PCSK9基因工程小鼠的饲养繁殖及鉴定

（海南省药物研究所，海南 海口 570311）

前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）基因是 2003年被发现的一个脂质代谢调节蛋白[1]，它是哺乳动物前蛋白转化酶家族的第九个成员，其结构组成包括信号肽、前结构域、催化结构域和 C-末端结构域[2]。PCSK9基因在肝脏、小肠及肾脏等组织中均有表达，它在胆固醇和脂质代谢过程中具有非常重要的作用[3]。研究表明，PCSK9基因参与脂质代谢主要是通过促进肝细胞的低密度脂蛋白受体 (low density lipoproteinreceptor，LDLR)的降解[4]，使血液中低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的水平上升[5]，从而引起高胆固醇血症的发生[6-9]。因此，PCSK9是人类高胆固醇血症的主要致病基因之一[10]。

PCSK9基因已经成为治疗高胆固醇血症的潜在靶点。PCSK9抑制剂可通过抑制或降低PCSK9基因，阻断PCSK9介导的LDLR降解，上调细胞表面 LDLR，从而下调LDL-C的水平，有效治疗高胆固醇血症，减少心血管疾病的发生。因此，通过繁育获得足够数量的PCSK9基因工程小鼠疾病模型，对于开展高胆固醇血症等心血管疾病的研究与治疗具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

野生型C57BL/6小鼠和PCSK9基因工程小鼠均饲养于海南省药物研究所实验动物中心SPF级动物房中。

1.2 主要试剂与仪器

酚，氯仿，无水乙醇，Triton X-100，蛋白酶K，Trizma Hydrochloride Solution，2×Taq Master Mix（Dye Plus），琼脂糖，DNA Marker，0.5×TBE 缓冲液，基因组DNA提取试剂盒。

电子分析天平，电热恒温水箱，PCR仪，低温高速离心机，电泳仪，凝胶成像系统。

1.3 试验方法

1.3.1 PCSK9基因工程小鼠的饲养与繁殖。小鼠饲养于海南省药物研究所实验动物中心SPF级屏障环境中，饲养温度为 22～26 °C，相对湿度为 50%～70%，人为控制昼夜明暗交替，自由饮水和采食。饲料为Co60辐照饲料，垫料为玉米芯颗粒，饮用水经净水器过滤处理并高压灭菌。每天进入动物房观察小鼠生长情况，添加饲料并更换饮水。隔天更换垫料。

初期采用基因工程小鼠的杂合子首建鼠与野生型小鼠长期合笼的方式进行繁殖，对子代小鼠通过PCR和测序进行基因型鉴定，对鉴定为阳性的小鼠采用雌雄1∶1的比例合笼，通过繁育获得稳定遗传的子代小鼠。子鼠出生3周后断奶分笼饲养。

1.3.2 小鼠的基因型鉴定。鼠基因组DNA的提取。小鼠出生后7 d左右对其进行剪趾编号，剪取2～5 mm小鼠尾组织置于1.5 mL EP管中，加入300 μL含有Triton X-100和蛋白酶K的鼠尾裂解液，56°C裂解过夜。将300 μL酚氯仿颠倒混匀，12 000 rpm离心10 min，吸取上清液至新的EP管中。加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀。4°C条件下，12000 rpm离心 5 min，弃去上清液。加入500 μL 70%的乙醇，洗涤 2次。4℃条件下，12000 rpm离心5min。弃去上清液并在超净工作台中干燥，加入预热的ddH2O溶解即得到基因组DNA。

采用PCR反应和琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定。以基因组DNA作为模板，用于PCR扩增。上游引物为 5′-TATGTCCATGTATTCTGACAGGCT-3′， 下游引 物 为 5′-AGCTGTTGACACTCAGAAAAGCAA-3′。PCR反应采用25 uL体系进行扩增，按照试剂盒说明书上的加样体系和PCR扩增程序进行，采用6×loading buffer终止反应，并利用2%琼脂糖凝胶电泳的方法鉴定PCR反应产物。小鼠尾部组织琼脂糖凝胶电泳结果显示为在551 bp处有一条带的即鉴定为阳性。

通过测序进行基因型鉴定。对PCR检测结果为阳性的个体进行进一步鉴定，并根据测序结果选择阳性个体开展后续繁育。

2 结果

2.1 小鼠基因型鉴定结果

PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

图1 小鼠PCR鉴定结果

经过 PCR 扩增， 1、2、6、8、18、23、27、29、30 共 9个个体可以扩增出551bp的目的条带，鉴定结果为阳性。PCR检测为阳性的个体的测序结果见图2。

图2 PCR产物测序结果

测序结果显示，1、2、6、8、18、23、27、29、30 号个体缺失13202bp。

3 讨论

由于基因工程小鼠数量较少，在传代过程中可能造成基因的丢失或改变，因此在饲养繁育方面，其要求更高一些。要严格控制昼夜明暗交替的时间，同时对饲料、垫料、饮水等所有物品都必须严格消毒。处于哺乳期的雌性小鼠对外界环境的刺激比较敏感，光线和噪音等因素都可能导致其神经系统紊乱，进而出现食仔的现象。所以在繁育期间要尽可能地减少外界刺激，除了换水加料、更换笼具，尽量不要打扰繁育期的雌鼠。可以每周互换雄鼠，这样能够增加雌鼠怀孕的几率。对鉴定为非转基因的仔鼠要及时淘汰，而对一些比较珍贵的基因工程小鼠可以采取保存冷冻精液和胚胎的方式进行保种。

PCR鉴定是利用基因工程小鼠基因组与野生型小鼠基因组的序列差异，以小鼠基因组DNA作为模板进行PCR，并根据凝胶电泳的条带不同来区分不同的基因型。所提取的基因组DNA的浓度及PCR反应体系、反应条件等都可能会影响PCR的结果。对于PCR结果为阳性的小鼠，可以进一步进行测序鉴定，对测序结果为阳性的个体可以根据需要进行留种继续繁育，或者用于后续的试验研究。