河南地方绵羊品种LHR基因的多态性分析

邵俊红，付俊伟，董智豪，白俊艳＊，陈梦柯，付学言，冀 祥，韩志洪，崔晗晗，彭 彬

（1.河南省汝州市动物卫生监督所，河南 汝州 467500；2.河南科技大学动物科技学院，河南 洛阳 471023）

促黄体素受体 (LHR)是属于G蛋白偶联受体(GPCR)超家族中的糖蛋白亚家族成员，其氨基酸序列和结构有高度同源性，具有7个跨膜区、4个胞质区以及由3个环状区和N端组成的细胞外区，细胞外区中大约有14个不完全重复的富含亮氨酸的序列。其不但有与跨膜区发生反应后介导信号传导的特性，而且还具有结合黄体生成素 （LH）的作用。葛立军等[1]（2007）在多种动物包括灵长类动物、猪、牛、火鸡以及人的子宫内都发现有促黄体素(LH)或人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其mRNA的结合位点。狄冉等[2](2009)检测了促黄体素受体(LHR)基因外显子11在性早熟、高繁殖力山羊品种(济宁青山羊)和性晚熟、低繁殖力品种(波尔山羊、安哥拉山羊和内蒙古绒山羊)中的单核苷酸多态性，结果发现，仅引物P3和P6的扩增片段具有多态性。申颖等[3]（2009）在探究LHR基因在济宁青山羊发情周期的不同阶段于子宫中的表达差异时，发现LHR mRNA在整个发情周期的子宫中都有表达,但各时期表达量不同。王利红等[4]（2011）在探究绵羊促黄体素受体基因（LHR）外显子11多态性与繁殖性能的相关性的过程中，发现设计的引物中只有两个引物的扩增片段具有多态性。本研究将PCR-SSCP技术与测序相结合，对小尾寒羊、大尾寒羊和豫西脂尾羊的LHR基因进行种群内和种群间的多态性分析，为绵羊品种的改良和保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

分别采集来自濮阳的小尾寒羊、来自平顶山的大尾寒羊和来自偃师乌龙村的豫西脂尾羊的血样，各48只，采用颈部静脉采血方法，经抗凝处理后在冰壶中低温保存运回实验室，血样于-20℃条件下保存备用。

1.2 试验方法

引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。 具体为：F:5'-TCGTTTCCTCATGTGCAATCT-3'；R:5'-GGTATGCCATCTTTCTAGTGTGAT-3'，扩增产物片段大小为200 bp。PCR反应体系的总体积为15 μL，其中 1 uL 的 DNA，上、下游引物各为 1 μL,去离子水 4.5 μL， 以及 7.5 μL 的 2×Taq PCR Green Mix。PCR 扩增程序为：94 ℃预变性 4 min，35×（94 ℃变性 40 s，58 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 80 s），72 ℃继续延伸5 min，最后于4℃条件下保存。PCR产物经1%琼脂糖电泳，在紫外投射仪中进行观察，确定为阳性后在12%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。利用Excel软件统计基因型频率、基因频率以及多态信息含量等相关指标。

2 结果与分析

2.1 绵羊LHR基因的琼脂糖电泳结果

如图1所示，通过梯度PCR得知，58℃是该引物的最适退火温度。对该退火温度下的PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果发现特异性扩增良好，无拖尾，与预期片段大小200 bp相符，可进行SSCP分析。

图1 绵羊 LHR基因的琼脂糖检测结果

2.2 绵羊LHR基因的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

对小尾寒羊、大尾寒羊、豫西脂尾羊促黄体素受体（LHR）外显子11的PCR产物进行电泳，结果见图2。可以发现，在小尾寒羊中检测到AB、BB两种基因型，在豫西脂尾羊中检测到AA、AB、BB三种基因型，在大尾寒羊中检测到AB、BB两种基因型。

图2 绵羊LHR基因的聚丙烯酰胺凝胶电泳图

2.3 绵羊LHR基因的群体遗传学分析

从表1可以看出，促黄体素受体（LHR）外显子11在小尾寒羊、大尾寒羊和豫西脂尾羊中存在三种基因型，记为AA、BB和AB。其中小尾寒羊AA的基因型频率为0.045，AB的基因型频率为0.295，BB的基因型频率为0.659。豫西脂尾羊AA基因型频率为0.174，AB的基因型频率为0.261，BB的基因型频率为0.565。大尾寒羊AB基因频率为0.098，BB基因频率为0.902。促黄体素受体（LHR）外显子11在小尾寒羊中的遗传杂合度（He）为0.312，有效等位基因数（Ne）为 1.452，多态信息含量（PIC）为 0.263。在豫西脂尾羊中的遗传杂合度 （He）为0.423，有效等位基因数（Ne）为 1.734，多态信息含量（PIC）为 0.256。在大尾寒羊中的遗传杂合度 （He）为0.093，有效等位基因数（Ne）为 1.108，多态信息含量（PIC）为 0.089。

表1 绵羊LHR基因的群体多态性分析

2.4 绵羊LHR外显子11的测序分析

选择LHR外显子11的AA、AB、BB这三种基因型的PCR产物直接测序，测序比对结果见图3。发现不同基因型之间有5个位点发生突变，LHR在37位发生G、A的突变；在49位发生T、C的突变；在93位发生T、C突变；在139位发生T、G突变；在184位发生A、G突变。

图3 绵羊LHR基因的不同基因型测序结果

3 讨论

LHR基因是动物体内较为重要的调节因子之一，国内外许多学者都对其进行了研究。本研究采用PCR-SSCP技术分析了小尾寒羊、豫西脂尾羊和大尾寒羊LHR基因外显子11的多态性，SSCP结果同样检测到了AA、AB、BB这三种基因型。此外，寸静宇[5]（2019）在探究绵羊LHR基因的多态性时发现，其所探究的LHR基因7个SNPs在大多数绵羊品种中均表现为中度多态 (0.25＜PIC＜0.5)，且试验中该基因的所有位点在各个绵羊品种中均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)。 吴翠玲等[6]（2019）在研究新吉细毛羊中5个生殖激素受体基因的多态性时发现，LHR基因存在 T1262G、A1991G、C2012T、A2032T 和 T2041A的突变，但这些突变对其产仔数并无显著影响 （P＞0.05）。关于其他物种，王爱华等[7]（2003）发现，猪 LHR基因外显子11序列发生了一个碱基突变，但并没有造成该段蛋白序列的改变，为沉默突变。以上研究都对LHR基因的SNP位点进行了部分探索，虽与本试验研究目的不一致，但均表明LHR基因具有较高的碱基突变概率。