亚急性瘤胃酸中毒对瘤胃黏膜上皮细胞增殖与凋亡的影响

（巴彦淖尔市磴口县人民政府办公室，内蒙古 巴彦淖尔 015200）

近年来瘤胃酸中毒引起的瘤胃损伤逐渐成为研究热点，最新研究表明，急性和亚急性瘤胃酸中毒不仅影响了瘤胃上皮的组织形态，而且损害了瘤胃上皮的屏障功能（Steel et al，2009，2011）[1-5]。 针对瘤胃上皮细胞增殖与凋亡在瘤胃黏膜屏障功能中的作用也少见报道，本文建立SARA奶山羊模型，通过对瘤胃黏膜上皮细胞增殖、凋亡情况的改变进行研究，以探讨SARA在瘤胃黏膜屏障功能中的可能意义及其机制。

1 试验

1.1 试验设计

选取9只健康处于泌乳期的奶山羊为试验动物，按体重、泌乳量相近原则随机分为：对照组 （n＝3）、SARA 组（n＝3）和 SARA 恢复组（n＝3）。对照组饲喂基础日粮（NFC/NDF＝1.02）；SARA组通过饲喂非纤维性碳水化合物与中性洗涤纤维比 （NFC/NDF）为1.02、1.24、1.63和2.58的日粮诱导奶山羊发生SARA；恢复组：前期饲喂方法与SARA组相同，待SARA诱导成功后让奶山羊自由采食青干草4周，使试验奶山羊逐渐恢复。整个试验期，试验动物采用单笼饲养，每天07:00和19:00两次等量饲喂，自由饮水。

试验饲粮参照NRC（1981）奶山羊营养需求配制，试验饲粮组成与营养水平见表1。

表1 试验日粮的组成及营养水平

1.2 检测指标

1.2.1 瘤胃黏膜的取材与处理。对照组、SARA组和恢复组奶山羊宰杀前禁食12 h，宰杀后立即取瘤胃后背盲囊、后腹盲囊、前腹盲囊、前背盲囊及瓣胃组织块，去肌层，剔除结缔组织，去掉内容物后用无菌生理盐水反复冲洗干净，然后用吸水纸吸干组织块表面水分，用载玻片刮取各部位黏膜并立即置于冻存管中，标记后置于-80℃冰箱中保存待用；取上述组织块（1 mm3）置于4%戊二醛溶液中固定，用于电镜的观察；取组织块（1 cm×1 cm×1 cm）若干放于 10%的福尔马林中固定，进行PCNA和TUNEL的检测。

1.2.2 透射电镜的观察。取瘤胃后背盲囊、后腹盲囊、前腹盲囊、前背盲囊及瓣胃组织块（1 mm3）置于4%戊二醛溶液中固定，用于电镜切片的制作，分别观察对照组、SARA组及恢复组各组瘤胃上皮细胞细胞器的变化情况及是否有凋亡小体的形成。

1.2.3 黏膜生化数据测定。以牛血清白蛋白作为标准，参照 Lowry法[6]测定黏膜蛋白质含量；DNA和RNA含量测定采用二苯胺法[7]，以小牛胸腺 DNA作为标准。RNA含量通过测定332 nm和260 nm处的吸光值，用 Fleck-Begg[8]公式算出。

1.2.4 免疫组织化学染色标记上皮细胞PCNA。采用En-vosion法免疫组织化学染色标记PCNA、PCNA一抗（购于abcam公司抗体）。参照许岸高等[9]的标准每张切片在普通光学显微镜下连续观察至少5个以上高倍视野计数阳性细胞数，细胞核着棕褐色即为阳性染色细胞。随机计数每个瘤胃乳头上皮黏膜阳性细胞及细胞总数，计算阳性染色细胞所占的百分数，即细胞增殖指数（%）=阳性细胞数／总细胞数×100%。

1.2.5 TUNEL检测上皮细胞凋亡。参考Gabriel等方法，应用 TUNEL试剂盒（批号 122010，Roche公司），结合说明书的方法，稍有改动。每张切片在普通光学显微镜下连续观察至少5个以上高倍视野计数阳性细胞数，凋亡细胞即为细胞核中出现棕褐色颗粒或者细胞核质呈均匀的棕黄色，随机计数每个瘤胃乳头上皮总数及瓣胃黏膜阳性细胞及细胞总数，即凋亡指数（%）=阳性细胞数／总细胞数×100%。

2 数据统计分析

试验数据用平均值±标准差(X±S)表示，采用SAS 9.0统计软件中的ANOVA对数据进行方差分析，用Duncan法进行多重比较，P＜0.05为差异显著，P＞0.05为差异不显著。

3 结果

3.1 SARA对瘤胃黏膜形态的影响

由图1可以看出，对照组瘤胃上皮细胞微绒毛较整齐，细胞核较大，部分核染色质均匀，细胞器结构未见异常。SARA组上皮细胞微绒毛排列不整齐，线粒体肿胀、峭断裂，核固缩，核形不规则，核膜表面凸凹不平，染色质边集化，细胞核裂碎，胞浆浓缩，可见凋亡小体形成。

图1 瘤胃上皮透射电镜图

3.2 SARA对瘤胃黏膜蛋白质、DNA和RNA的影响

由表2可以看出，SARA组瘤胃黏膜上皮蛋白质显著低于对照组和恢复组（P＜0.05），恢复组显著低于对照组（P＜0.05）。DNA含量SARA组和恢复组显著低于对照组，SARA组和恢复组相比差异不显著 （P＞0.05）。RNA含量SARA组低于对照组和恢复组 （P＞0.05），3组间差异均显著 （P＜0.05）。与对照组相比，SARA组和恢复组瘤胃黏膜蛋白质含量分别下降了44%（P＜0.05）和 20%（P＜0.05），DNA 含量分别下降了51%和 44%，RNA含量分别下降了 94%和 58%；SARA组与恢复组相比，SARA组蛋白质、DNA和RNA含量分别下降了30%、13%和88% 。恢复组瘤胃黏膜上皮RNA/DNA最高，SARA组最低，3组间差异均不显著（P＞0.05）。

表2 SARA对瘤胃黏膜蛋白质、DNA和RNA含量的影响 (mg/g)

3.3 SARA对瘤胃黏膜上皮细胞增殖的影响

PCNA阳性细胞染色呈棕黄色，如图2所示。由表3可以看出，SARA组瘤胃PCNA阳性细胞数为（35.00±12.03），比对照组（64.67±8.29）明显高，恢复组PCNA阳性细胞数为（50.33±7.58），高于对照组且低于SARA组，SARA组与对照组及恢复组相比差异显著 (P＜0.05)，而恢复组与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。

图2 瘤胃上皮PCNA表达图（x200）

表3 SARA对瘤胃上皮细胞PCNA表达的影响（%）

3.4 SARA对瘤胃黏膜上皮细胞凋亡的影响

凋亡细胞的核经TUNEL染色呈棕褐色，正常细胞核呈绿色如图3所示。由图3和表4可以看出，SARA组瘤胃凋亡阳性细胞数为（62.5±8.38），比对照组（14.5±2.43）明显高，恢复组凋亡阳性细胞数为（42.0±10.92），高于对照组且低于SARA组，差异均显著(P＜0.05)。

图3 TUNEL法检测瘤胃上皮细胞凋亡图（x200）

表4 SARA对瘤胃上皮细胞凋亡的影响（%）

3.5 SARA对瘤胃和瓣胃上皮细胞凋亡指数与增殖指数比值(AI/PI)的影响

由表5可以看出，SARA组瘤胃上皮细胞凋亡率与增殖比值（1.78±0.21）与对照组（0.23±0.01）相比明显升高，恢复组为 （0.87±0.05），高于对照组且低于SARA 组，3 组差异均显著（P＜0.05），而对照组、SARA组及恢复组上皮细胞凋亡率与增殖比值分别为0.14±0.02、1.45±0.44、1.11±0.32，SARA 组 与 对 照 组 相比差异显著(P＜0.05)，而与恢复组相比差异不显著（P＞0.05）。

表5 SARA对瘤胃上皮细胞凋亡率与增殖比值的影响（%）

4 讨论

4.1 SARA对瘤胃黏膜形态及蛋白质、DNA、RNA含量的影响

本试验通过测定瘤胃黏膜蛋白质、DNA和RNA含量来揭示瘤胃上皮细胞的增殖情况。由表1可知，3组瘤胃黏膜RNA/DNA由高到低依次是对照组、恢复组及SARA组，而RNA/DNA值更确切地反映蛋白质合成情况。本试验表明，对照组瘤胃黏膜蛋白质合成强于恢复组，而SARA组最弱，这与直接测定蛋白质含量结果相一致。DNA含量能够间接地反映细胞增殖情况，本试验研究发现，瘤胃黏膜DNA含量对照组显著高于恢复组（P＜0.05）,而恢复组显著低于SARA组（P＜0.05），说明对照组瘤胃细胞增殖量高于恢复组和SARA组，SARA组最次。

目前，研究者普遍认为丁酸能够促进瘤胃上皮细胞的增殖。Sakata[10]研究认为，瘤胃快速灌注丁酸后，瘤胃上皮细胞指数分裂提高，并认为丁酸能够刺激瘤胃上皮细胞进行分裂，最终引起增殖。黄智南[11]再次证明，高营养日粮对瘤胃上皮细胞增殖有促进作用。本试验发现，3个试验组的奶山羊饲喂不同饲料，随着NFC/NDF比增加，SARA组瘤胃丁酸浓度增加，并且高于对照组和恢复组。SARA丁酸浓度最高，其细胞增殖反而弱于对照组和恢复组，这与黄智南（2010）瘤胃灌注丁酸，瘤胃上皮细胞有增殖趋势相反。之所以出现截然不同的结果，可能与SARA模型建立方式不同，也可能是处于SARA阶段的奶山羊瘤胃内丁酸浓度过高，超出瘤胃对丁酸的代谢作用，最终丁酸对瘤胃上皮细胞的增殖有抑制作用，但最主要的是SARA对瘤胃上皮细胞有损害作用。恢复组奶山羊在发生SARA后饲喂青干草，瘤胃上皮增殖能力反而强于SARA组，但是与对照组相比较弱些，这可能是瘤胃丁酸浓度降低，或者是粗饲料能刺激瘤胃上皮细胞发育的原因。

4.2 SARA对瘤胃黏膜上皮细胞增殖与凋亡的影响

瘤胃上皮细胞凋亡率受日粮NFC/NDF比影响，处于SARA阶段的奶山羊瘤胃上皮细胞凋亡较对照组明显增加，凋亡指数较对照组及恢复组存在显著性差异（P＜0.05），说明SARA时瘤胃上皮细胞发生过度性凋亡。瘤胃上皮发生过度性凋亡，导致瘤胃黏膜屏障遭到损伤，尤其是机械屏障。瘤胃角质层构成了黏膜的机械屏障，与胃内容物直接接触，因而受到损伤的几率最大。同时，当SARA发生时，瘤胃内VFA大量积累导致pH值升高，瘤胃处于异常应激状态，造成瘤胃黏膜破损、出血及溃疡[12]，从而导致上皮细胞凋亡进一步增加，胃黏膜的通透性增强，引起屏障功能减弱，大量内毒素及细菌由瘤胃壁进入血液循环造成内毒素血症[13]，进一步破坏瘤胃壁，加重了SARA的发展[14]。因而本试验可以推测SARA能促进瘤胃黏膜上皮细胞凋亡的发生，是导致瘤胃黏膜屏障功能障碍的一个重要因素。

瘤胃上皮细胞PCNA增殖指数受日粮NFC/NDF比影响，SARA组瘤胃上皮细胞PCNA增殖指数明显减少，与对照组相比差异显著 （P＜0.05），说明发生SARA时瘤胃上皮细胞PCNA表达减少，提示SARA对瘤胃黏膜细胞的增殖有抑制作用，不利于黏膜的损伤修复。恢复组PCNA增殖指数低于对照组，但明显高于SARA组，恢复组与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。说明恢复组的恢复情况好于SARA组，但不及对照组。

本试验研究发现，SARA组瘤胃上皮细胞AI/PI明显高于对照组，恢复组AI/PI值高于对照组且低于SARA组。说明奶山羊在发生SARA后停止诱导其中毒，再次给予青干草可以缓解SARA症状，但是恢复不到对照组状态。因此，从AI/PI角度考虑，SARA对奶山羊瘤胃上皮细胞的凋亡有促进作用，对增殖有抑制作用。

综上所述，处于SARA阶段奶山羊瘤胃上皮细胞凋亡率明显要高于对照组和恢复组，而细胞PCNA表达与凋亡率呈现相反结果，即SARA组低于对照组和恢复组，恢复组高于SARA而低于对照组。上皮细胞的凋亡与增殖的相对平衡是维持屏障完整性的保障，因此，SARA对瘤胃上皮细胞增殖受抑制而凋亡起到促进作用，黏膜屏障遭到严重破坏，进而加重SARA的发生。

5 结论

本研究发现，SARA组瘤胃黏膜蛋白质、DNA及RNA含量与对照组和恢复组相比，均呈现偏低趋势。说明SARA的发生降低了瘤胃黏膜蛋白质、DNA及RNA的含量。SARA对瘤胃上皮细胞的凋亡有促进作用，但是对瘤胃上皮细胞增殖活性有抑制作用。