MiR-449b表达对老年原发性肝细胞癌患者预后的影响

赵美琴，范晖，杨杰，徐海洋

1.南通大学附属如皋医院（如皋市人民医院）肿瘤内科，江苏如皋226500；2.徐州医科大学附属医院肿瘤科，江苏徐州221000

原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种常见的恶性侵袭性肿瘤，其发病率在全球范围内呈上升趋势[1]。尽管HCC 已在诊断和治疗策略方面取得了一定的进展，但通常由于发现较晚、易于复发和耐药性等原因，HCC 患者的临床预后并未得到改善[2]。探索HCC 发生和发展的分子机制，特别是遗传和表观遗传的改变，有助于发现新的生物标志物[3]。作为小的非编码核糖核酸（ribonucleic acid, RNA），微RNA（micro-ribonucleic acid, miRNA）在转录后调节基因表达，从而导致信使核糖核酸（messenger RNA, mRNA）降解和翻译抑制[4-5]。MiRNA 能调节数百个靶基因，并影响细胞增殖、凋亡和细胞迁移等肿瘤相关通路，在肿瘤的发生和进展中具有重要意义[6]。研究证实miR-449b 表达与多种肿瘤的预后及侵袭相关，但其对老年HCC 预后的影响尚不清楚[7]。本研究采用队列研究的方法探讨miR-449b 的表达对老年HCC 预后的影响，为老年HCC 的防治提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2013年1月—2015年1月于徐州医科大学附属医院肿瘤科接受肝癌根治性切除术治疗的老年HCC 患者176 例。手术过程中获取癌组织标本，并迅速保存于-80℃冰箱中。纳入标准：（1）年龄≥65 岁；（2）病理确诊为原发性HCC；（3）临床资料完整；（4）患者与家属对研究内容知情，并签署同意书。排除标准：（1）HCC 复发后手术治疗者；（2）肝移植；（3）预期生存时间较短；（4）合并其他肿瘤、自身免疫病、精神疾病或严重基础疾病者。176例患者年龄66～82 岁，平均（70.3±2.7）岁，其中男性141 例、女性35 例。本研究经伦理委员会审批通过（伦理编号KY20120403）。

1.2 MiR-449b 检测 将冰冻组织标本经液氮研磨后加入Trizo（lInvitrogen,北京索莱宝公司）提取总RNA，离心后取上清。RNA 定量采用超微量分光光度计NanoDrop1000（美国Nanodrop 公司），以DNase 去除DNA 污染，通过Omniscript 逆转录试剂盒（Qiagen 205111，上海玉博生物科技有限公司）合成cDNA，用无核酸酶水以1: 20 稀释并保存。将cDNA 0.5L、正向和反向引物0.5L 及反应缓冲液12.5L 混合于ABI Prism7300 系统中。以U6 作为内参，37℃15 min、85℃5 s 条件下进行实时荧光聚合酶链反应。见表1。

1.3 随访方法 采用门诊、电话与上门相结合的方式进行随访，第1年每3 个月随访1 次，第2年每6 个月随访1 次，第3年起每年随访1 次，随访患者的生存状况，随访日期截至2020年1月。患者的肿瘤确诊时间为该患者的生存起始时间，终点时间为死亡时间或终止观察时间（2020年1月），总生存时间（overall survival, OS）定义为起始时间至终点时间。研究期间共失访8 例，随访率为96%。随访的168 例患者中，死亡97 例。

表1 引物序列

1.4 统计学方法 采用SPSS 21.0 进行统计分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用独立样本 检验进行组间比较。计数资料用例数和百分率表示，采用2检验进行组间比较。通过受试者操作特征（receiver operator characteristic, ROC）曲线评估miR-449b对HCC 预后的预测值；Kaplan-Meier 和Log-rank检验进行单因素生存分析，寻找影响HCC 预后的潜在危险因素。将单因素分析中差异有统计学意义的变量引入多因素Cox 比例风险回归模型，分析影响老年HCC 患者预后的因素＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 根据既往文献报道[8-9]，选择性别、年龄、蔡尔德-皮尤改良（Child-Turcotte Pugh, CTP）评分、是否感染肝炎病毒、肿瘤大小、有无淋巴结转移、TNM 分期等指标进行分析。176 例患者miR-449b表达水平为（0.37±0.06），患者中位OS 为48 个月（4～60 个月）。见表2。

表2 一般资料（ =176）

2.2 MiR-449b 对 HCC 患者生存率的诊断价值MiR-449b 预测老年HCC 患者死亡的临界值为0.36。当miR-449b 为0.36 时，miR-449b 预测老年HCC 患者死亡的敏感度为72.23%，特异度为70.38%，曲线下面积（area under the curve, AUC）为 0.712（=0.001）。见图1。

图1 MiR-449b 预测HCC 死亡的ROC 曲线

2.3 H CC 患者生存率的单因素分析Kaplan-Meier 和Log-rank 检验显示，CTP 评分B 级、肿瘤直径>5 cm、淋巴结转移和miR-449b 低表达会增加老年HCC 患者的死亡风险。见表3、图2。

表3 HCC 患者生存率的单因素分析

2.4 HCC 患者生存率的多因素分析 将Kaplan-Meier和Log-rank 检验结果显示差异有统计学意义的变量纳入多因素Cox 比例风险回归模型，结果显示CTP评分B 级、较大肿瘤直径>5 cm、淋巴结转移和miR-449b低表达是老年HCC患者死亡风险增加的独立危险因素（＜0.001）。见表4。

图2 MiR-449b 表达与老年HCC 患者生存的相关性

表4 HCC 患者生存率的多因素分析

3 讨论

HCC 是常见的恶性肿瘤之一，我国是HHC 的高发地区[10-11]。虽然相关临床治疗方法在不断完善，但HCC 患者的复发风险和不良预后率仍居高不下[12]。既往研究表明，早期诊断与有效的治疗可显著改善HCC 患者的预后[13]。因此，与HCC 患者相关的高特异性、敏感性生物标志物研究亟待展开。

MiRNA 作为重要的遗传物质近年来受到重视，可调控靶基因的mRNA 转录后水平，在细胞分化、增殖和代谢等多个过程中发挥作用。研究显示，miR-449b在多种肿瘤中表达异常，参与调控肿瘤细胞的生物学行为。前列腺癌中miR-449b 的低水平表达与根治性前列腺切除术后生化复发相关[14]。同时，miR-449b低表达可增加非小细胞肺癌患者不良预后的风险[15]。MiR-449b 在肺癌组织中表达水平降低，且miR-449b靶基因HDAC1 的表达水平升高[16]。上述研究均提示miR-449b 可能具有肿瘤特异性，因此研究老年HCC患者的miR-449b 表达具有一定的临床价值。

本次研究发现miR-449b 预测老年HCC 患者预后的AUC 面积为0.71，敏感度为72.23%，特异度为70.38%，可见miR-449b 对于预测老年HCC 患者预后有一定价值。进一步分析发现，miR-449b 低表达是HCC 患者预后的独立影响因素，miR-449b 表达降低的老年HCC 患者预后更差。此外，肿瘤直径、有无淋巴结转移和CTP评分也与老年HCC 患者预后独立相关。这些指标反映了患者的肿瘤分期特征和肝功能水平，其预测价值已被证实[8-9]。目前，miR-449b表达与HCC 发生、发展的关系尚不清楚。研究显示miR-449b 的转染抑制了细胞增殖和迁移，从而诱导细胞凋亡，并不同程度地降低了肿瘤的生长速率[17]。此外，miR-449b 可直接靶向SOX4 转录后表达，而SOX4 可编码一种参与上皮间质转化和HCC 转移的转录因子，从而抑制转化生长因子-b 介导的细胞迁移[6]。

综上所述，miR-449b 在老年HCC 癌组织中的表达上调可能参与了HCC 的发生发展，miR-449b 低表达患者预后更差。MiR-449b 可作为潜在的老年HCC治疗靶点，而miR-449b 通过哪些分子机制作用于HCC 还有待于进一步的研究。