N-乙酰半胱氨酸对哮喘小鼠模型气道炎症和氧化应激的影响

徐莉莉，张军，尚璐璐，丁慢玲，郑金旭

(1. 江苏大学附属医院呼吸科，江苏 镇江 212001； 2. 江苏大学附属澳洋医院呼吸科，江苏 苏州 215600)

支气管哮喘(简称哮喘)是以嗜酸性、中性粒细胞炎症和气道高反应性为特征的最常见的气道疾病之一[1]。哮喘患者气道中炎症细胞和结构细胞可产生大量活性氧,机体有一定的抗氧化能力，但是当活性氧过多时，造成气道上皮、内皮等结构不同程度的损伤，进而加重气道炎症，增加气道高反应性等[2-4]。组织核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)是一种氧化还原敏感的碱性亮氨酸拉链转录因子，参与多种抗氧化基因的转录调控。研究表明，激活Nrf2表达能减轻卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)诱导的哮喘小鼠的炎症[5-6]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是半胱氨酸的乙酰基衍生物，增加细胞内还原型谷胱甘肽含量，中和氧化剂[7]。目前，NAC在肺部疾病中如慢性阻塞性肺疾病[8]、急性呼吸窘迫综合征[9]、间质性肺疾病[10]等的治疗中发挥抗炎、抗氧化作用。但NAC对哮喘的作用及机制尚未有明确研究[11-12]。为此，本研究探讨NAC对哮喘模型小鼠气道炎症和氧化应激的影响及可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雌性BALB/c小鼠18只，6～8周，体重18～22 g，购自江苏大学实验动物中心[许可证号：SYXK(苏)202003784]。

1.1.2 主要试剂和仪器 OVA(Ⅴ级，美国Sigma公司)；氢氧化铝凝胶(美国Pierce公司)；氮乙酰半胱氨酸泡腾片(江苏大学附属医院，进口药品注册证号：H20150548，意大利Zambon S.p.A.公司)；丙二醛、谷胱甘肽试剂盒(南京建成生物工程研究所)；IL-13、IL-5、IFN-γ ELISA试剂盒(美国Proteintech公司)；PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；引物及内参(GADPH)序列由金唯智公司设计合成，序列：HO-1上游5′-AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA-3′，下游5′-GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA-3′；Nrf2上游：5′-TAGATGACCATGAGTCGCTTGC-3′，下游5′-GCCAAACTTGCTCCATGTCC-3′；GAPDH上游5′-TGGATTTGGACGCATTGGTC-3′，下游5′-TTTGCACTGGTACGTGTTGAT-3′；超声雾化器(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)；PCR仪器(美国Thermo公司)；酶标仪(美国Bio-Rad公司)；微量移液器(德国Eppendorf公司)；HE染液试剂盒(武汉谷歌生物有限公司)；血细胞计数板(上海求精有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 哮喘模型构建 参照文献[13-14]建立哮喘模型。按随机数字法将18只小鼠均分为对照组，哮喘组，N-乙酰半胱氨酸组，每组6只。致敏阶段：第1天、第8天、第15天予哮喘组和N-乙酰半胱氨酸组每只小鼠腹腔注射致敏液0.2 mL(内含100 μg OVA+2 mg氢氧化铝凝胶+0.2 mL PBS)；激发：于第22天开始，每天予2.5% OVA雾化吸入45 min，连续1周。对照组均予PBS替代，N-乙酰半胱氨酸组在每次雾化前30 min予NAC(300 mg/kg)灌胃，对照组和哮喘组予等量PBS灌胃。

1.2.2 取材和检测

1.2.2.1 ELISA法测定血清中相关细胞因子含量 1%戊巴比妥(10 mL/kg)腹腔注射麻醉小鼠，待其活动减弱后，眼球采血，置于EP管，每只约1 mL；冰上静置3 h，分离血清；4 ℃，3 000 r/min离心10 min，按照说明书分别检测IL-5、IL-13和IFN-γ含量。

1.2.2.2 BALF细胞总数及分类计数 采血处死后，将小鼠固定于手术板，颈部常规备皮、消毒，暴露气管，“T”形切口，插管，夹紧气管套管，0.8 mL预冷PBS注入肺，回抽并轻轻按摩肺部。重复3次，每次回收率>80%。4 ℃，1 500 r/min离心15 min；弃上清液，用1 mL PBS重悬，用血细胞仪计数细胞总数，瑞士染色分类计数，用光学显微镜计至少200个细胞，按标准形态分计中性粒细胞、嗜酸性粒细胞。

1.2.2.3 肺组织样本采集 肺泡灌洗结束后，每组小鼠均沿着颈部切口向下剪开胸部皮肤，逐层剥离肌肉和组织，暴露胸腔，取肺组织以备后续检测。

1.2.2.4 HE染色及炎症评分 取左肺用4%中性多聚甲醛室温固定48 h，中间换液一次；石蜡包埋、切片4 μm，溶蜡，二甲苯脱蜡，降级浓度梯度乙醇脱水，水洗；苏木素染色3 min，水洗；分色、氨化，水洗；伊红液染色2 min；乙醇脱水，二甲苯透明；中性树脂封固、烤片。在高倍显微镜下观察，使用Image Pro软件采集图片。炎症评分细则根据文献[15]如下，根据血管和支气管周围炎症细胞浸润程度进行评分：0分，无炎症细胞；1分，偶尔有炎症细胞缠绕；2分，薄层(1～5)层炎症细胞包围；3分，炎症细胞层厚>5层。

1.2.2.5 肺组织丙二醛和谷胱甘肽测定 取右肺组织，超声匀浆机研磨，4 ℃，4 000 r/min离心15 min；取上清液，按照说明书检测丙二醛、谷胱甘肽含量。

1.2.2.6 实时荧光定量PCR测Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表达 超声匀浆机研磨肺组织，用Trizol提取总RNA，按说明书逆转录合成cDNA，反应体系：引物混合液2 μL、dNTP混合液 4 μL、二硫苏糖醇2 μL、RNA模板4 μL、 缓冲液4 μL、逆转录酶 1 μL和无酶水 3 μL。PCR反转录仪上进行孵育，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min，-20 ℃保存。以cDNA为模板，配制荧光定量PCR反应体系：2×SYBR GreenⅠ预混液10 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、DNA模板2 μL和无酶水6.4 μL，共20 μL。PCR条件：95 ℃反应10 min；95 ℃反应15 s；60 ℃反应60 s；40个循环，计算2-ΔΔCt值分析相关mRNA表达。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 各组小鼠血清炎症因子的比较

与对照组相比，哮喘组血清细胞因子IL-5、IL-13含量显著增加(t=5.090，12.443，P<0.05)，IFN-γ含量明显降低(t=-10.344，P<0.05)。与哮喘组相比，N-乙酰半胱氨酸组中血清细胞因子IL-5、IL-13含量明显降低(t=-4.568，-12.981，P均<0.05)，IFN-γ含量明显增加(t=14.109，P<0.05)。见图1。

a：P<0.05，与对照组相比；b：P<0.05，与哮喘组相比

2.2 各组小鼠支气管肺泡灌洗液细胞数比较

如图2所示，与对照组相比，哮喘组白细胞总数、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数显著增加(t=10.491，39.099，12.323，P均<0.05)；与哮喘组相比，N-乙酰半胱氨酸组白细胞总数、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数明显减少，差异有统计学意义(t=-6.658，-19.704，-5.154，P均<0.05)。

a：P<0.05，与对照组相比；b：P<0.05，与哮喘组相比

2.3 各组小鼠肺组织炎症的比较

肺组织HE染色显示，对照组肺泡及气道结构规整，管腔无狭窄，偶有少量炎症细胞。哮喘组肺组织结构明显紊乱，肺泡结构破坏明显，管腔狭窄，炎症渗出明显，血管周围水肿；N-乙酰半胱氨酸组炎症和肺组织损伤程度较哮喘组减轻。3组中哮喘组小鼠评分最高，哮喘组评分明显高于对照组(t=7.675，P<0.05)，N-乙酰半胱氨酸组评分明显低于哮喘组(t=-8.935，P<0.05)。见图3。

a：P<0.05，与对照组相比；b：P<0.05，与哮喘组相比

2.4 各组小鼠肺组织中丙二醛和谷胱甘肽含量的比较

与对照组比较，哮喘组肺组织中丙二醛含量明显升高，谷胱甘肽含量明显降低 (t=7.974，-4.850，P均<0.05)；与哮喘组比较，N-乙酰半胱氨酸组中丙二醛含量明显降低，而谷胱甘肽含量明显升高(t=-6.709，5.772，P均<0. 05)。见图4。

a：P<0.05，与对照组相比；b：P<0.05，与哮喘组相比

2.5 各组小鼠肺组织HO-1 mRNA和Nrf2 mRNA表达比较

与对照组比较，哮喘组小鼠肺组织中Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表达差异无统计学意义(P均>0.05)；与哮喘组相比，N-乙酰半胱氨酸组肺组织Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表达明显升高(P均<0.05)。见图5。

a：P<0.05，与对照组相比；b：P<0.05，与哮喘组相比

3 讨论

哮喘动物模型是研究抗哮喘药物及探究其发病机理的关键步骤，以OVA诱导哮喘小鼠模型，具备与人哮喘相似的临床症状和病理表现，是构建哮喘的理想模型[14]。本实验采用OVA诱导，成功构建哮喘模型小鼠，并将NAC作为干预药物，研究结果显示NAC具有抗哮喘作用。

嗜酸性粒细胞和中性粒细胞是哮喘重要的效应细胞，嗜酸性粒细胞在炎症部位释放的颗粒蛋白刺激黏液生成，引起组织水肿和气道阻塞，释放各种细胞因子和趋化因子，加重炎症[16]。中性粒细胞可以分泌多种炎症介质和细胞因子，促进炎症反应，导致气道重塑[17]。哮喘与Th1/Th2细胞失衡及其特有的细胞因子谱密切相关[18]。本研究显示，相对于对照组，OVA诱导的哮喘小鼠炎症细胞数、IL-5、IL-13水平显著增加，IFN-γ水平显著降低，肺组织HE染色显示气道周围有大量炎性细胞、结构紊乱、破坏。NAC的干预明显减少炎症细胞数量，降低Th2细胞因子水平，增加Th1细胞因子水平，减轻上述气道病理损伤表现，且炎症评分明显降低。由此推测，NAC能缓解哮喘小鼠气道炎症反应。

丙二醛是脂质过氧化中最丰富的活性醛，是细胞损伤的重要信号分子，作为细胞和组织氧化应激的指标[19]。谷胱甘肽是细胞内主要的硫醇抗氧化剂，是活性氧清除剂，在维持上皮完整性方面起着重要作用[20]。在本研究中，NAC显著抑制OVA诱导的氧化应激，NAC组小鼠肺组织中丙二醛含量减少，谷胱甘肽含量升高，提示NAC通过抗氧化反应对OVA诱导的哮喘有保护作用。

Nrf2/HO-1信号通路轴在调节氧化应激、炎症反应中起关键作用[5,21]。为进一步研究NAC保护机制，本实验研究NAC对Nrf2/HO-1信号通路的影响。结果表明N-乙酰半胱氨酸组Nrf2、HO-1mRNA表达明显升高。由此推测NAC可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路起抗哮喘作用，这与Sussan等[22]研究显示的激活Nrf2表达能降低哮喘易感性观点一致。