基于UPLC-Q-TOF-MS结合网络药理学的黄褐毛忍冬保肝活性成分及其潜在靶点研究

刘畅，刘雄伟，丁晶鑫，李嘉欣，尹志刚，周英,3

(1.贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550025； 2. 贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025； 3. 贵州省药食同源植物资源开发工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025)

黄褐毛忍冬(L.fulvotomentosaHsu et S. C. Cheng)是忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)植物，为中国药典收载山银花的基原植物，味甘、寒，归肺、心、胃经，具有清热解毒、疏散风热之功效(中国药典，2015版)。其主要含有绿原酸、皂苷类、醇类、酯类、黄酮类等多种化合物[1-3]，具有解热、抗菌、抗内毒素、抗病毒、抗炎、降血糖血脂、免疫调节、保肝、抗氧化功能等功效[4]。黄褐毛忍冬水提物及醇提物能够使四氯化碳致急性肝损伤小鼠的血清谷丙转氨酶、肝脏三酰甘油及肝脏丙二醛的含量降低，水煎液较醇提物具有更好的保肝作用[5]，但对其含有的主要药效成分和分子作用机制尚不清楚。故鉴定黄褐毛忍冬的主要成分与作用靶点对阐释其药效物质基础和分子作用机制具有重要意义。

超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)目前已被广泛应用于中药化学成分的快速鉴定[6]，将液质联用技术(LC-MS)扫描的碎片离子信息和化合物裂解规律与对照品或文献比对，可快速、准确地分析中药中所含化学成分[7]。网络药理学(network pharmacology)利用复杂的网络模型构建药物、靶点与疾病间的相互作用关系网，阐述中药的多成分-多靶点-多途径作用关系，可预测化学成分作用的靶点和揭示中药成分复杂的作用机制[8]。整合化学物质组学和网络药理学，可为中药质量标志物(Q-marker)的发现提供更有效的研究方法和路径[9]。

因此，本研究拟利用UPLC-Q-TOF-MS快速解析和鉴别黄褐毛忍冬中的化学成分，同时结合网络药理学和生物信息学手段发现其主要作用节点和通路，预测黄褐毛忍冬保肝作用的潜在靶点。从化学物质组学和网络药理学角度探究黄褐毛忍冬的多成分、多靶点、多途径保肝作用机制，为寻找黄褐毛忍冬的质量标志物，有效控制中药质量奠定基础。

1 材料与方法

1.1 药材及化学试剂

黄褐毛忍冬采自贵州省兴义市安龙县德卧镇水井村，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为黄褐毛忍冬的干燥花蕾。无水乙醇(AR，天津市富宇精细化工有限公司)；乙腈、甲醇(GR，阿拉丁试剂有限公司)；乙酸(GR，北京迈瑞达科技有限公司)；芦丁(纯度≥97%)，绿原酸(纯度≥98%)，新绿原酸(纯度≥98%)，隐绿原酸(纯度≥98%)，异绿原酸A(纯度≥98%)，异绿原酸B(纯度≥98%)，异绿原酸C(纯度≥98%)，咖啡酸(纯度≥98.5%)，上述标准品购自成都普思生物科技股份有限公司；α-常春藤皂苷(纯度≥98%)，灰毡毛忍冬皂苷甲(纯度≥98%)，灰毡毛忍冬皂苷乙(纯度≥98%)，断氧化马钱子苷(纯度≥98%)，木犀草苷(纯度≥97%)，异槲皮苷(纯度≥98%)，断马钱子酸(纯度≥99%)，上述标准品购自成都瑞芬思生物科技股份有限公司。

1.2 主要仪器

Acquity UPLCTM液相色谱仪，Acquity UPLC®BEH C18 Column(美国Waters集团公司)，Xevo G2-XS QTof (ESI离子源，美国Waters集团公司)，SG8200HPT超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液和供试品溶液制备 分别精密称量10 mg标准品，以甲醇有机溶液作为溶媒，超声至标品全部溶解完全，配置成标准品储备液，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，于4 ℃冰箱中储存备用。取黄褐毛忍冬干品适量，蒸馏水回流提取，以料液比1∶20，1.5 h/次，提取3次，趁热抽滤，合并3次提取的滤液，水浴蒸干得供试品浸膏，于4 ℃冰箱中储存备用；取适量浸膏加甲醇超声溶解，置于10 mL容量瓶中加甲醇至刻度，摇匀，制备成1 g/mL(相当于每毫升含1 g生药的溶液)的药液，进样前用0.22 μm的微孔滤膜滤过。

1.3.2 色谱条件 色谱仪：Acquity UPLCTM液相色谱仪(四元梯度泵，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器，在线真空脱气机)；色谱柱：Acquity UPLC®BEH C18 Column(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；柱温：40 ℃；流动相：A相为乙腈溶液，B相为0.4%乙酸水溶液；洗脱梯度条件：流速0.4 mL/min；进样量2 μL；色谱仪流出液不经分流直接注入质谱仪进行检测。梯度洗脱程序: 0～1 min，5% A，95% B；1～18 min，98% A，2% B；18～20 min，5% A，95% B。

1.3.3 质谱条件 采用ESI电喷雾源，分别在正、负离子模式下采集数据，数据扫描范围质子数/电荷数(m/z)：50～1 500。离子源参数：喷雾电压1 500 V，锥孔采样电压：40 V；离子源温度：110 ℃；气帘气流量：50 L/h；去溶剂气温度：112 ℃；去溶剂气流量(N2)：800 L/h；碰撞能量：20～30 V；用Masslynx 4.1工作站进行数据的采集和后续分析处理。

1.3.4 药物成分的吸收 根据Lipinski类药五原则，将鉴定出的化合物导入Molinspiration网站(http:∥www.molinspiration.com/cgi-bin/properties)，依据其油水分配系数的对数值(logP)、相对分子质量(MW)、拓扑极性表面积(TPSA)、氢键给体数(nON)、氢键受体数(nOHNH)与旋转键数(nrotb)等性质预测药物分子的吸收情况[10-11]。符合以下规则： ① nON≤5，② nOHNH≤10，③ MW<500，④ logP为-2～5，⑤ nrotb≤10的化合物会有更好的药动学性质，在生物体内代谢过程中会有更高的生物利用度。如果一个化合物违反了其中两个规则将可能有水溶性或透膜性差的问题。

1.3.5 有效成分作用靶标和疾病相关靶点的收集 利用ALOGPS 2.1(http:∥www.vcclab.org/lab/alogps/)平台，将黄褐毛忍冬化合物结构图转化为标准的Canonical SMILES格式。将Canonical SMILES格式文件导入Swiss Target Prediction平台(http:∥www.swisstargetprediction.ch/)和Similarity ensemble approach (SEA)数据库(http:∥sea.bkslab.org/)，将其属性设置为“homo sapiens”，预测化学成分的潜在靶点，利用UniProt数据库将这些靶蛋白转换成对应的基因名称。通过GeneCards(https:∥genecards.weizmann.ac.il/v3/)，以“acute liver injury”为关键词检索与肝损伤相关的基因，筛选并删除重复靶点基因，与化合物作用的靶点基因进行交集比对，最终获得化合物-疾病靶点。

1.3.6 “有效成分-靶点”和蛋白与蛋白相互作用网络图构建 将化学成分与候选靶点导入Cytoscape 3.7.1软件，建立成分-靶点网络。为了分析靶点间的相互作用，将候选靶点导入String数据库，获得靶点间相互作用关系，保存为TSV格式，把条目node1和node2数据导入Cytoscape 3.7.1软件，计算度(degree)值，将靶点大小和颜色设置用于反映节点(node)数的大小，颜色的深浅设置用于反映结合分数的大小，从而获得最终的蛋白互作网络。应用KOBAS3.0(http:∥kobas.cbi.pku.edu.cn/)工具对化合物-靶点交集蛋白靶标进行KEGG通路富集分析(P<0.05)，筛选黄褐毛忍冬主要化学成分参与的生物学通路。

2 结果

2.1 黄褐毛忍冬的化学成分鉴定及吸收预测

采用UPLC-Q-TOF-MS技术对黄褐毛忍冬中的化学成分进行定性分析，通过一级和二级质谱信息分析并结合相关文献，黄褐毛忍冬水提物样品图谱中共鉴定和表征出57个化学成分，主要为黄酮、有机酸、生物碱、环烯醚萜、皂苷等类型的化合物(图1)。根据Lipinski类药五原则，利用Molinspiration网站对所鉴定的化合物进一步进行生物利用度预测，结果发现24种成分均可能被吸收(表1)，包括奎尼酸(Quinic acid)，獐牙菜苷(Sweroside)，新绿原酸(Neochlorogenic acid)，4,6-O-亚乙基-α-D-葡萄糖(Ethylidene glucose)，绿原酸(Chlorogenic acid)，隐绿原酸(Cryptochlorogenic acid)，断氧化马钱苷酸(Secologanoside)，断马钱子酸(Secologanic acid)，5-对香豆酰基奎宁酸(5-p-coumaroylquinic acid)，桃叶珊瑚甙元(6′-O-beta-Glucosylaucubin)，木犀草苷(Cynaroside)，栀子苷(Gardenoside)，甲氧基香豆素(7-Methoxycoumarin)，3-O-阿魏酰奎尼酸(3-O-feruloylquinic acid)，幼枝含断氧化马钱子甙(Secoxyloganin)，断马钱子苷半缩醛内酯(Vogeloside)，幼枝含断氧化马钱子甙甲酯(Secoxyloganin methyl ester)，异槲皮苷(Isoquercitrin)，槲皮素(Quercetin)，山柰酚-7-葡萄糖苷(Kaempferol-7-glucoside)，山柰酚(Kaempferol)，忍冬甙(Lonicerin)，槲皮素-7-O-葡萄糖苷(Quercetin-7-O-β-glucopyranoside)，齐墩果酸(Oleanolic acid)。

A: BPI-; B: BPI+

2.2 黄褐毛忍冬主要化学成分靶点预测及筛选

利用Swiss Target Prediction数据库筛选到329个靶点，利用SEA数据库筛选到279个靶点，删除重复共得到551个靶点。在GeneCards数据库检索与急性肝损伤相关的基因共6 089个。将此网络与黄褐毛忍冬对应靶点功能相映射，筛选得到319个黄褐毛忍冬潜在的靶点。

2.3 候选化合物-靶点网络分析

将化合物和靶点导入Cytoscape分析软件，构建黄褐毛忍冬化学成分-靶点作用网络(图2)，其中化学成分、靶点用节点表示，化学成分与靶点的相互关系用边(edge)表示，有16个成分作用于同一靶点碳酸酐酶2(CA2)，138个靶点仅与一个成分链接，存在一个化学成分与多个靶点相互作用和不同化学成分作用于同一个靶点的现象，表现了中药的多成分、多靶点相互作用的特点。每种化合物作用于多个靶点，每个靶点也可由多个化合物产生作用。从靶点角度来看，较为重要的靶点有CA2(degree=16)，醛糖还原酶1(AKR1B1，degree=15)，碳酸酐酶1(CA1，degree=14)，碳酸酐酶9(CA9，degree=14)，血管内皮生长因子A(VEGFA，degree=14)，白介素2(IL-2，degree=13)，内质网氨肽酶基因1(ERAP1，degree=12)，成纤维细胞生长因子1(FGF1，degree=11)，成纤维细胞生长因子2(FGF2，degree=11)，醛氧化酶5(ALOX5，degree=10)，腺苷受体A1(ADORA1，degree=10)，碳酸酐酶4(CA4，degree=10)等。从化合物角度来看，较为重要的化合物为山柰酚(degree=98)、槲皮苷(degree=93)、齐墩果酸(degree=78)、甲氧基香豆素(degree=73)、栀子苷(degree=47)、隐绿原酸(degree=39)、木犀草苷(degree=39)、4,6-O-亚乙基-α-D-葡萄糖(degree=38)、山柰酚-7-葡萄糖苷(degree=38)、断马钱子苷半缩醛内酯(degree=35)、绿原酸(degree=34)、新绿原酸(degree=34)、奎尼酸(degree=30)、3-O-阿魏酰奎尼酸(degree=30)、异槲皮苷(degree=30)等。

2.4 靶点PPI网络构建

将黄褐毛忍冬预防急性肝损伤的靶点导入String数据库中，设定打分值为高置信度0.900，获得蛋白相互作用关系，将其保存为TSV文件，导入Cytoscape中构建蛋白互作网络，得到254个节点和1 268条边，选取degree>10作图，得到蛋白互作网络(图3)。靶点两两之间的互作作用各不相同，其中颜色深浅反映该靶点连接其他靶点个数的多少，用度(degree)体现，degree值越高，颜色越深(黄色)表明该靶点的作用越关键。对其进行拓扑分析，依据相关参数：度(degree)，介度(betweenness)，紧密度(closeness)大小，确定了网络中的11个关键核心靶标：磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3R1，degree=54)，淀粉样前体蛋白(APP，degree=48)，丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3，degree=46)，原癌基因(SRC，degree=39)，热休克蛋白90α(HSP90AA1，degree=36)，丝/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1，degree=36)，转录激活因子3(STAT3，degree=33)，血管内皮生长因子(VEGFA，degree=29)，表皮生长因子受体(EGFR，degree=29)，B细胞κ轻肽基因增强子核因子1(NFKB1，degree=28)，ppGpp合成酶基因(RELA，degree=27)。

表1 黄褐毛忍冬水提物化学成分鉴定分析

续表1

图2 黄褐毛忍冬化合物-靶点网络

图3 蛋白网络互作

2.5 靶标功能富集分析及“成分-靶标-通路-功能”网络的构建

利用KOBAS 3.0在线软件进行KEGG生物通路分析结果表明，319个靶点主要富集在242个信号通路(P<0.05)，得到急性肝损伤相关的26个功能条目(表2)，涉及PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、cAMP信号通路、TNF信号通路、钙信号通路、Toll样受体信号通路、PPAR信号通路、AMPK信号通路、Wnt信号通路、Notch信号通路、Hippo信号通路、Hedgehog信号通路等。

将富集分析得到的26个主要通路对应黄褐毛忍冬主要成分及靶点，构建“化学成分-靶点-通路”网络模型。此网络绿色节点代表黄褐毛忍冬中的活性成分，黄色节点代表潜在靶点，紫色节点代表调控通路，边代表三者之间的相互作用(图4)。从富集通路的多少来看，较为重要的通路为PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、cAMP信号通路、钙信号通路、TNF信号通路、Relaxin信号通路等，较为重要的靶点为AKT1、PIK3R1、PRKCA、丝裂原活化蛋白激酶10(MAPK10)、核内原癌基因(JUN)、EGFR、NFKB1、糖原合成酶激酶3(GSK3B)、RELA、肿瘤坏死因子(TNF)、HRA、白介素6(IL-6)、磷酸酶C(PLCG1)、FOS、核转录因子κB(NFKBIA)、VEGFA、环磷腺苷效应元件结合蛋白1(CREB1)、钙/钙调素依赖性蛋白激酶2β(CAMK2B)、胰岛素受体(INSR)和白介素-1B(IL-1B)等。AKT1富集到13个相关的通路，PIK3R1富集到13个相关的通路，PRKCA富集到10个相关的通路，MAPK10和JUN富集到9个相关的通路，EGFR、NFKB1、GSK3B和RELA富集到8个相关的通路，TNF和HRAS富集到7个相关通路，IL-6、PLCG1、FOS和NFKBIA富集到6个相关通路，VEGFA、CREB1、CAMK2B、INSR和IL-1B富集到5个相关通路。多条通路之间是通过共有靶点连接，表明各条通路之间可能协同作用于黄褐毛忍冬的预防急性肝损伤作用。

表2 黄褐毛忍冬作用靶点的KEGG富集分析

绿色三角形表示活性成分；黄色圆圈表示潜在靶点；紫色箭头表示通路

3 讨论

本实验采用UPLC-Q-TOF-MS对黄褐毛忍冬水提物的化学成分进行了定性研究，结果显示黄褐毛忍冬提取物主要含有57种成分，其中24种化学成分可能被吸收，包括酚酸类，黄酮类、三萜皂苷类等。通过“化学成分-靶点-通路”关系网络的搭建、拓扑参数的分析及生物通路的信息挖掘对黄褐毛忍冬保肝的化学成分、潜在作用靶点及其分子机制进行了分析，结果显示黄褐毛忍冬中隐绿原酸、木犀草苷、绿原酸、新绿原酸、山柰酚、槲皮苷、齐墩果酸、栀子苷、断马钱子苷半缩醛内酯等可能作用于CA2、AKR1B1、CA1、CA9、VEGFA、IL-2、ERAP1、FGF1、FGF2、ALOX、ADORA1、CA4等靶点发挥保肝作用。

基于拓扑参数分析，较为重要的化合物为山柰酚、槲皮苷、异槲皮苷、木犀草苷、栀子苷、隐绿原酸、绿原酸、新绿原酸、齐墩果酸、奎尼酸、3-O-阿魏酰奎尼酸等。山柰酚能够通过抑制JNK磷酸化，降低肝细胞氧化应激，保护线粒体功能，抵抗DNA断裂诱发细胞凋亡，从而达到保护过量对乙酰氨基酚导致的肝细胞损伤[12]。异槲皮苷能够通过激活Wnt/β-catenin信号通路抑制脂肪细胞分化[13]，调控AMPK信号通路改善肝细胞脂质代谢[14]。木犀草苷能够减少非酒精性脂肪肝脂质的沉积，减轻氧化应激及炎症反应程度，提高脂联素受体2的表达，对非酒精性脂肪肝具有较好的保护作用[15]。绿原酸能够通过JNK途径抑制非酒精性脂肪性肝病大鼠模型中的自噬和胰岛素抵抗，减轻高脂饮食诱导的肝损伤[16]。这些化学成分可能是黄褐毛忍冬预防急性肝损伤的关键成分。

通过网络药理学方法对其化学成分-靶点相互关系进行构建，其保肝活性主要与CA1、CA2、CA4、CA9、AKR1B1、ERAP1、ALOX5、FGF1、FGF2、VEGFA、IL-2密切相关。肝癌组织中，下调CA1和CA2的表达可促进肿瘤细胞的生长和转移[17]。人醛氧化酶是活性氧产生的来源，其表达反映了机体产生活性氧的水平和决定了肝细胞对药物的易感性，脂联素可以下调醛氧化酶水平从而避免脂肪肝的形成[18]。FGF1是一种具有多种生理功能的代谢调节因子，能够通过抑制氧化和内质网应激，保护对乙酰氨基酚诱导的肝损伤[19]。FGF2与创伤修复和细胞增殖密切相关，通过ERK1/2和JNK信号协同调节肝细胞的有丝分裂[20]。

进一步分析黄褐毛忍冬急性肝损伤靶点所涉及的信号通路，通路富集分析结果显示主要涉及PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、cAMP信号通路、TNF信号通路、钙信号通路、Toll样受体信号通路、PPAR信号通路、AMPK信号通路、Wnt信号通路、Notch信号通路、Hippo信号通路、Hedgehog信号通路等。Hedgehog信号通路通过调节效应细胞的增殖和活化，并抑制细胞的凋亡，在损伤肝脏的再生修复进程中发挥重要的作用[21]。Hippo信号通路能够影响肝星状细胞的转分化、增殖和凋亡，进而影响药物及胆汁淤积引起的肝纤维化的发生[22]。在成熟的健康肝脏中，Wnt/β-catenin信号通路途径几乎是无活性的，但在肝脏肿瘤的发生和发展、肝脏炎症、肝硬化、肝脏局灶性结节性增生等肝脏疾病的发生中扮演重要的角色[23-25]。Wnt/β-catenin信号通路能够与Hippo/YAP信号通路、NF-κB信号通路以及Notch信号通路等存在多位点的交叉联系，在机体生理病理过程中的功能性关联具有牵一发而动全身的联动效应[26]。黄褐毛忍冬作用于急性肝损伤是多靶点、多通路、多功能的复杂网络结构机制，多条通路协同发挥作用。

综上所述，本研究基于UPLC-Q-TOF-MS分析技术对黄褐毛忍冬水提物中化学成分进行了鉴定，并利用化学物质组学与网络药理学方法初步分析了黄褐毛忍冬预防急性肝损伤的主要化学成分，探讨了其预防急性肝损伤可能的分子机制，为黄褐毛忍冬质量标志物的确定奠定了研究基础。