解毒生肌膏对糖尿病溃疡皮肤微生态平衡的作用机制

陈 丽，廖亮英，戴飞跃，王 瑜，张 扬，陈敏敏，黄洁雅，叶永鑫，周忠志*

（1.湖南中医药大学，长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，长沙 410007）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种由多病因引起的以血糖慢性升高为主要特征的终身性代谢性疾病，皮肤溃疡是其常见并发症之一[1-2]。近年来，微生态研究受到大量学者关注，它是指在一定组织内，微生物群在此进行物质交换、能量传递及信息交流的统一系统[3-4]。在糖尿病溃疡发生发展中，皮肤创面微环境也随之发生改变，为溃疡创面的转归提供了必要的物质基础，在其中扮演了重要角色，影响糖尿病溃疡愈合[5-6]。因此，我们尝试从稳定创面微环境去研究促进糖尿病溃疡愈合的治疗方法。

解毒生肌膏是由全蝎、蜈蚣、乳香、没药按君臣佐使原则配伍制成，是指导老师在临床治疗糖尿病溃疡的有效经验方。本课题通过制备2 型糖尿病皮肤溃疡大鼠模型[7]，采用肉眼观察、Masson 染色法等方法观察创面愈合情况及镜下形态学，探究解毒生肌膏对糖尿病溃疡皮肤微生态平衡的影响。

1 实验材料

健康雄性SD 大鼠（SPF 级）30 只，4～6 周龄，体质量180～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司供给；实验操作过程中对动物的处置符合2009年《Ethical Issues in Animal Experimentation》中关于动物伦理学标准的条例。饲养环境为清洁级。室温保持在20～25 ℃，湿度保持在45%～75%。大鼠分笼饲养，每笼5 只大鼠。实验期间饲以大鼠标准饲料，自由饮水、饮食，每天补充1 次水和饲料，每2 d 更换1 次垫料，并清洗、消毒笼具。解毒生肌膏，从湖南中医药大学第一附属医院购买全蝎、蜈蚣、乳香和没药，按一定比例混合磨碎加工制成，实验全过程使用同种药物；银锌皮肤黏膜抑菌霜，珠海亿胜生物制药有限公司（S2004000）；水合氯醛,天津市科密欧化学试剂有限公司（CAS：302-17-0）；链脲佐菌素（STZ），sigma-aldrich 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；柠檬酸钠缓冲液（Solabio Cat#C1013），北京索莱宝科技有限公司；高脂乳剂原料：丙硫氧嘧啶，源叶生物（530643）；胆酸钠（猪），源叶生物（S30219）；1,2-丙二醇，湖南省天虹试剂有限公司；吐温-80，天津市科密欧化学试剂有限公司；食用猪油（QS430102030013）；4%多聚甲醛,长沙市开福区灏扬生物试剂经营部（AR1068）；精密pH 试纸，上海三爱思试剂有限公司（2190215）；LFT-1 红外线敏感温度计，20106800025812。

2 实验方法

2.1 模型制备 大鼠适应性喂养3 d，用高脂乳剂于每天同一时间段以2 mL/只的剂量连续灌胃14 d[8]；采用随机数表法将30 只大鼠随机分为模型组（10 只）、解毒生肌膏组（10只）、银锌皮肤黏膜抑菌霜组（10只）。3 组均以40 mg/kg 的剂量腹腔注射STZ 建立糖尿病模型[9]，在造模前和造模3 d后采用剪尾法测量随机血糖，之后禁食不禁水12 h 测量空腹血糖，采用电子秤每周称得大鼠平均体质量。造模成功标准：造模前随机血糖＜8.9 mmol/L，造模后随机血糖≥16.7 mmol/L，空腹血糖≥11.1 mmol/L，大鼠体质量明显下降。继而参照赵京禹[10]、李友山[11]等方法制备糖尿病创面模型：采用10%水合氯醛3.5 mL/kg 腹腔注射将大鼠麻醉，呈腹卧位固定，背部脱毛，用络合碘与乙醇消毒处理后在大鼠背部以脊柱为轴在肩胛骨下缘约2 cm 处左右对称创设2 个直径为1.5 cm 的圆形全层皮肤缺损区域，深至筋膜，即成功建立2 型糖尿病大鼠背部全层皮肤缺损模型。

2.2 干预方法 将造模成功的大鼠按照组别分别给予以下处理：模型组不做任何处理，解毒生肌膏组于创面均匀涂抹复方解毒生肌膏药物，银锌皮肤黏膜抑菌霜组于创面均匀涂抹银锌皮肤黏膜抑菌霜试剂。并对3 组大鼠每天进行换药观察处理直至处死，分笼饲养大鼠并自由饮食。

2.3 标本采集 各组分别于建立2 型糖尿病大鼠背部全层皮肤缺损模型后3、7、14、21 d，取4 个时间点造模的大鼠，用10%水合氯醛麻醉，对创面进行拍照记录。继而以创面为中心取得大小为2 cm ×2 cm 的标本，于4%多聚甲醛瓶中固定，常温保存，制成组织形态病理切片，用Masson 染色观察细胞和组织形态进行组织学分析。

2.4 指标检测 宏观观察并记录3 组大鼠不同时间点的愈合情况，利用Image J 计算出各时间点大鼠背部创面愈合面积，创面愈合率=（原始创伤面积-检查时伤口面积）/原始创伤面积×100%。

将固定在4%多聚甲醛中的标本送至湖南中医药大学显微形态实验室，经75%、85%、90%、95%Ⅰ、Ⅱ浓度梯度乙醇及无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ脱水，放入二甲苯透明，浸蜡包埋，切片机（厂家：LEICA;型号：RM2235）进行切片，37 ℃摊片，捞片，按顺序装篮，60 ℃的恒温箱内烤片，烤片2 h。

将石蜡标本制成5 μm 厚的切片，常规Masson 染色光学显微镜下观察创面组织炎性反应、胶原改变、坏死组织存留及脱落、新生上皮生长等形态学变化。

2.5 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计量资料满足正态性及方差齐性以均数±标准差（）表示，否则使用中位数及四分位间距M（P25,P75）表述，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK 检验。

3 结果

3.1 肉眼观察情况 模型组：造模后1 h 创面分泌物较多，创面湿润，创缘略显肿胀；造模后3 d 创面有少量脓点并有较多分泌物，创缘明显肿胀，可见新生肉芽组织；造模后7 d 创面无明显脓性分泌物，创缘开始收敛，创口面积略减小；造模后14 d 创面虽仍未完全愈合，但创缘明显收缩，创面存在痂皮；造模后21 d 部分痂皮脱落，创面呈愈合趋势。结果见图1。

解毒生肌膏组：与模型组相比，造模后1 d 创面较干燥，创缘肿胀轻微；造模后3 d 创面分泌物较少，创缘肿胀明显，可见新生肉芽组织；造模后7 d 创面面积有较为明显的收缩，创面干燥，有大量肉芽组织生成；造模后14 d 创面覆盖有薄层痂膜，创缘明显收缩；造模后21 d痂皮脱落，基本完全愈合。结果见图1。

银锌皮肤黏膜抑菌霜组见图1：根据各个时间段愈合情况与解毒生肌膏组相比，造模后3 d 从创面愈合情况来看，解毒生肌膏组的创面较为肿胀，总体来说解毒生肌膏对创面的愈合效果较银锌皮肤黏膜抑菌霜组好。结果见图1。

3.2 创面愈合率比较 与模型组比较，解毒生肌膏组与银锌皮肤黏膜抑菌霜组在造模后3 d 到7 d 创面面积均缩小，造模后7 d缩小更显著，且具有统计学意义（P＜0.05），阳性对照组比模型组的愈合率小。见表1。

表1 3 组创面愈合率比较（，n=20） %

表1 3 组创面愈合率比较（，n=20） %

注：与模型组比较，# P ＜0.05

3.3 Masson 染色情况 造模后3 d：模型组炎症细胞浸润也较少，新生肉芽组织较少，胶原纤维少且排列紊乱，见图2-ABC；解毒生肌膏组创面可见炎症细胞浸润较多，新生肉芽组织较多，见图2-DEF；银锌皮肤黏膜抑菌霜组也有较多的炎症细胞，新生的肉芽组织较多，胶原纤维较多，见图2-GHI。造模后7 d：模型组炎症细胞浸润明显增多，肉芽组织生成增加，但是比解毒生肌膏组少，见图3-ABC；解毒生肌膏组炎症细胞浸润减少，新生肉芽组织增多，胶原纤维较多且排列紧密，出现小动脉，且成纤维细胞也较多，见图3-DEF；银锌皮肤黏膜抑菌霜组炎症细胞较多，新生肉芽组织较多，胶原排列较为整齐，见图3-GHI。

3.4 创面pH 值测定结果 由于实验后期创面有痂膜生成，无法直接测得创面及分泌物pH 值，所以pH 值检测时间点为3、7、10 d，检测结果显示：3、7 d 时间点解毒生肌膏组创面pH 值低于模型组和银锌皮肤黏膜抑菌霜组；10 d 时间点解毒生肌膏组pH 值高于模型组和银锌皮肤黏膜抑菌霜组。其中，与模型组比较，解毒生肌膏组在7 d 时间点时pH 值低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

3.5 创面温度测定结果 创面温度测定结果显示，解毒生肌膏组和模型组、银锌皮肤黏膜抑菌霜组之间在每个时间点的创面温度差别不大，无统计学意义（P＞0.05），见表3。

图2 3 d 时间点3 组创面形态学（Masson 染色）

图3 7 d 时间点3 组创面形态学（Masson 染色）

表2 3 组创面pH 值

表3 3 组创面温度测定结果 （°）

4 讨论

糖尿病溃疡是糖尿病严重的并发症之一，是临床常见的慢性难愈性创面，具有病程长、复发率高、易感染、易致截肢或引发脓毒血症等特点，极其影响人类健康，并带来严重的经济负担和社会负担[12-13]，其愈合过程受多细胞、多因子的影响，其中微生态的变化在糖尿病溃疡的治愈中扮演尤为重要的角色。

皮肤微生态是由皮肤所含微生物、宿主皮肤与内外环境构成的整体，它们相互协调，保持动态平衡[14]，而糖尿病溃疡即一个由庞大、复杂的微生物群构成的微生态环境。现代研究表明[15-16]，高糖环境可能导致微生态中的温度、pH 值、免疫功能等物理、化学、生物因素紊乱，打破其动态平衡，从而造成创面长期难以愈合。因此在治疗中，如何恢复糖尿病溃疡微生态中的平衡，达到治愈糖尿病溃疡的目的，应引起足够的重视。

解毒生肌膏是由全蝎、蜈蚣、乳香、没药按君臣佐使原则配伍制成，具有解毒祛瘀生肌之功效。本实验通过构建大鼠背部全层皮肤缺损模型，设立模型组、解毒生肌膏组和银锌皮肤黏膜抑菌霜组。肉眼观察用药前后及不同组别溃疡的创面面积、肉芽组织生长情况、创周水肿、脓液分泌等情况，发现解毒生肌膏组于造模后3、7 d 创面愈合速率明显增快、质量明显高。Masson 染色表明：造模后3 d，解毒生肌膏组较其他组新生表皮更长，胶原、肉芽组织丰富，大量炎细胞浸润，炎症期反应明显加强；造模后7 d，模型组和银锌皮肤黏膜抑菌霜组胶原、肉芽组织有所增多，炎细胞浸润较解毒生肌膏组明显，炎症期反应强于同期解毒生肌膏组和该组3 d 时反应程度。以上结果说明解毒生肌膏可改善创面微生态从而促进糖尿病溃疡愈合。

以往研究表明，创面的酸碱度对溃疡的影响无统一定论[17-18]，糖尿病溃疡患者由于体内呈高糖状态，致代谢改变，免疫障碍，从而直接影响细胞生长因子以及细胞促炎因子的分泌，使溃疡局部微环境缺血缺氧，pH 值降低，抑制成纤维细胞和角质形成细胞增值迁移减少，致溃疡愈合困难[19-20]。本实验研究表明，解毒生肌膏可使创面pH 值在造模后趋于正常，形成较合适的化学环境，加速溃疡愈合。

物理因素——创面的温度，既往研究也尚无意义[21]，本次实验也验证了这一点，由此猜想虽然理论上降低炎症反应会使创面温度也降低，但是由于糖尿病溃疡的发生已属于晚期并发症，解毒生肌膏即便减轻炎症反应，而对于温度改变并不大。

本实验通过建立糖尿病大鼠全层皮肤缺损模型，观察皮肤溃疡肉眼及镜下愈合情况、测量创面pH 值，证实中药解毒生肌膏可通过调节创面pH值趋向正常，抑制创面炎症状态以改善创面微生态从而促进糖尿病皮肤溃疡的愈合，但其能否影响整个皮肤创面微环境包括物理、化学、生物因素，从而促进溃疡愈合还需进一步研究。