苗药黑骨藤中绿原酸在大鼠体内药动学研究

刘 耀，胡 蝶，程 纯，刘 杰，傅 建，徐 剑*

（1.贵州中医药大学，贵阳 550025；2.国家苗药工程技术研究中心，贵阳 550025；3.贵州省普通高等学校中药民族药制剂重点实验室，贵阳 550025）

苗药黑骨藤为萝藦科（Asclepiadaceae）杠柳属（Periploca）植物黑龙骨（Periploca forrestii Schltr.）的干燥根或全株[1]，具有通络、活血、解毒、祛风的功效。现代药理研究表明，黑骨藤具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、免疫调节、抗氧化等作用[2-6]。化学成分研究表明，黑骨藤中富含黄酮、皂苷、多酚、挥发油等活性成分[7-11]。其中多酚类成分绿原酸的含量相对较高，其具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、保护心血管及中枢神经系统、降糖、免疫调节等诸多药理活性[12-19]，具有一定的代表性。本研究采用UPLC-MS/MS 技术建立了大鼠血浆中绿原酸浓度的测定方法，研究黑骨藤不同给药剂量下绿原酸在大鼠体内的药动学过程。

1 实验材料

ACQUITY UPLC-Xevo TQ 超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（美国Waters 公司）；Auw120D 型电子天平（日本岛津公司）；MTN-2800D 氮吹仪（天津奥特塞恩斯仪器有限公司）；SK8210HP 超声波清洗机（上海科导超声仪器有限公司）；TGL-16B 高速离心机（上海安亭科学仪器厂），MX-S 涡旋仪（美国scilogex 公司），色谱柱ACQUITY UPLC CSH C18色谱(150 mm×3.0 mm,1.7 μm）（美国Waters 公司）。

黑骨藤饮片，购于贵州同济堂中药饮片有限公司；绿原酸对照品（批号：110753-201415，中国食品药品检定研究院）；葛根素对照品（批号：110752-201514，中国食品药品检定研究院）；甲醇（批号：17080670，TEDIA 公司，色谱纯）；乙腈（批号：17080654，TEDIA 公司，色谱纯）；甲酸（批号：J259K144，德国CNW 公司，色谱纯）；纯净水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；肝素钠(批号：160228，上海蓝季生物）。

18 只SD 大鼠，雌雄各半，体质量150～180 g，购自于长沙市天勤生物技术有限公司，合格证编号：SCXK（湘）2014-0011，动物房环境：温度18～26 ℃，相对湿度40%～70%。

2 方法

2.1 色谱与质谱条件 色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC CSH C18（150 mm×3.0 mm,1.7 μm）色谱柱，流动相为乙腈-水（0.2%甲酸）（体积比20：80）等度洗脱，流速为0.3 mL/min，柱温25 ℃，进样体积为2 μL。质谱条件：采用电喷雾（ESI）离子源，毛细管电离电压：3 kV；离子源温度：120 ℃；去溶剂气温度：550 ℃；扫描方式为正离子多反应离子检测模式，用于定量分析监测的离子反应为：绿原酸m/z355.32 →163.2，葛根素m/z417.220 →297.136；锥孔电压8 V，碰撞能量为24。

2.2 对照品与内标溶液的制备 精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇浓度为165.6 μg/mL 的标准溶液，于4 ℃下避光保存，临用时取出稀释至所需浓度。精密称取葛根素对照品适量，加甲醇溶解制成，浓度为166.8 μg/mL 的内标溶液，于4 ℃下避光保存，临用时取出稀释至所需浓度。

2.3 给药 取18 只SD 大鼠，随机分为3 组，按不同剂量灌胃给予黑骨藤药材提取物（以提取物中绿原酸含量计算，低剂量6.4 mg/kg、中剂量13.1 mg/kg、高剂量25.0 mg/kg），于给药前及给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h 经大鼠眼眶取血，置于肝素钠处理的EP 管中，8 000 r/min 离心15 min，取上层血浆，-20 ℃冷冻保持备用。

2.4 血浆处理 取上述血浆样品100 μL，置于1.5 mL的EP 管中，精密加入内标溶液10 μL，涡旋震荡1 min，加入400 μL 乙腈，涡旋震荡3 min，于14 000 r/min 离心10 min，取上清液，于35 ℃下N2 吹干，用100 μL 的甲醇复溶，涡旋震荡3 min，超声1 min，于14 000 r/min 离心10 min，取2 μL 采用UPLC-MS/MS 进行检测分析。

2.5 数据处理 将采集所得到的不同时间点大鼠血药浓度数据采用DAS 2.0 软件进行分析处理，得到不同给药剂量黑骨藤中绿原酸的药动学参数，数据以均数±标准差（）表示，进行药动学分析，并绘制平均血药浓度-时间曲线。

3 结果

3.1 方法学考察

3.1.1 专属性试验 按上述色谱条件，比较空白血浆、空白血浆加绿原酸和葛根素和给予黑骨藤提取物后大鼠血浆样品色谱图，结果表明大鼠血浆中内源性物质对于绿原酸和内标物葛根素的测定没有干扰，绿原酸和内标物葛根素的保留时间分别为3.94 min 和3.32 min，表明该方法具有良好的专属性，结果见图1。

图1 血浆中绿原酸和葛根素MRM 色谱图

3.1.2 线性范围与定量限 取大鼠空白血浆100 μL，加入不同浓度的绿原酸标准溶液10 μL 及0.166 8 μg/mL的葛根素内标溶液10 μL，其余按“2.4”项下方法配制相当于绿原酸血浆质量浓度分别为0.018、0.045、0.090，0.255、0.450、2.250 μg/mL 的样品。在“2.1”条件下，进行分析，以绿原酸浓度为横坐标（X），以绿原酸与内标物葛根素的峰面积比值为纵坐标（Y），得回归方程为：Y=3.422 1X-0.011 6（r=0.999 9），结果表明绿原酸在0.018～2.250 μg/mL 范围内线性关系良好，绿原酸最低定量限（LOD）为0.018 μg/mL。

3.1.3 精密度及准确度试验 精密吸取空白血浆100 μL，加入不同浓度的绿原酸标准品溶液，配制成定量下限及高、中、低4 种浓度（18、90、450、2 250 ng/mL）的质控样品，每种浓度各5 份样本，按“2.4”项下进行操作，按“2.1”项下条件连续测定3 d，将峰面积比值代入标准曲线进行计算。对比实测与已知样品浓度，计算绿原酸的日内、日间精密度（RSD）及准确度，结果表明，该方法的精密度和准确度符合生物样品定量分析方法要求，结果见表1。

3.1.4 稳定性试验 精密吸取空白血浆100 μL，加入不同浓度的绿原酸标准品溶液，制备成高、中、低3种浓度（90、450、2250 ng/mL）的质控样品，每种浓度各5 份样本，按“2.4”项下进行操作，分别考察25 ℃放置24 h，-80 ℃反复冻融3 次的稳定性。结果表明样品放置于不同的温度下稳定性良好，结果见表2。

3.1.5 基质效应与回收率试验 精密吸取空白血浆100 μL，加入不同浓度的绿原酸标准品溶液，配制成高、中、低3 种不同浓度（90、450、2 250 ng/mL）的质控样品，每种浓度各6 份样本，按“2.4”项下进行操作，按“2.1”项下条件进行分析，计算绿原酸与内标物葛根素峰面积的比值为A；另取空白血浆100 μL，按“2.4”项下不加入内标溶液操作至乙腈沉淀蛋白，吸取上清液，向其中加入上述相应浓度的绿原酸与葛根素混合对照品溶液，按“2.1”项下条件进行分析，计算其峰面积之比为B；取上述相应浓度的绿原酸及葛根素混合对照品，按“2.1”项下条件进行分析，计算其峰面积之比为C。其中基质效应=B/C×100%，回收率=A/C×100%。结果表明，绿原酸的提取回收率88.76%～113.28%，RSD 小于4.68%；绿原酸基质效应范围为88.01%～99.83%，RSD 小于7.97%，符合生物样品定量分析方法要求，结果见表3。

表1 UPLC-MS/MS 法测定黑骨藤中绿原酸的精密度与准确度

表2 UPLC-MS/MS 法测定黑骨藤中绿原酸稳定性考察结果

表3 大鼠血浆中绿原酸提取回收率及基质效应（n=6）

3.1.6 残留考察 在进样定量上限绿原酸对照品后进样空白血浆样品，结果空白血浆样品中未显示任何显著的峰（≥20%的绿原酸对照品和5%的内标），且本研究采用等度洗脱结束后平衡1 min，加上仪器自带的洗针系统，可以有效的避免了样品残留问题。

3.2 药动学研究 采用DAS 2.0 软件对大鼠给药后的不同时间血药浓度数据进行房室模型拟合，发现不同给药剂量黑骨藤中绿原酸在大鼠体内的药动学过程均与一室房室模型符合较好，拟合后的药动学参数见表4，药-时曲线见图2。

表4 不同给药剂量绿原酸大鼠体内药动学参数（，n=6）

表4 不同给药剂量绿原酸大鼠体内药动学参数（，n=6）

图2 不同给药剂量绿原酸大鼠药-时曲线

4 讨论

4.1 测定方法 本试验采用UPLC-MS/MS 法，对大鼠血浆中的绿原酸进行测定，较传统的HPLC 法，具有快速、灵敏度高等优点，仅需5 min 即可完成大鼠血浆样品的分析，并采用MRM 模式可快速筛查出血浆样品中的目标成分，具有极高的灵敏度与专属性。

4.2 内标的选择 葛根素与绿原酸结构相似，均具有多个苯环及酚羟基，在测定的色谱条件下进行分析，葛根素保留时间适宜，与目标成分绿原酸完全分离，峰型良好，且血浆中内源性物质对检测没有干扰，故选择葛根素为绿原酸血浆样品测定的内标。

4.3 黑骨藤中绿原酸在大鼠体内的药动学行为 大鼠口服给予黑骨藤后，对高、中、低不同剂量所获得的药动学参数Cmax 及AUC0-t 与给药剂量进行一元线性回归分析，分别得到回归方程为：Y=0.031 3X-0.029 9（r=0.999），Y=0.119 1X-0.047 89（r=0.988），表明在6.4～25 mg/kg 剂量范围内，黑骨藤中绿原酸在大鼠体内表现为线性动力学特征，各剂量下绿原酸达峰时间（Tmax）均为1.5 h。较文献对比[20-22]，黑骨藤中绿原酸的吸收出现滞后现象，不同剂量给药后Tlag分别为0.450、0.466、0.425 h，提示黑骨藤中其他化学成分可能会对绿原酸的吸收产生竞争抑制作用。经过统计学分析，低剂量组与中、高剂量组结果有显著差异（P＜0.05），结果提示不同给药剂量对大鼠体内绿原酸的消除速度有一定影响，随着剂量的递增，消除速度逐渐减小，当达到一定剂量后趋于平衡。

综上所述，本试验采用UPLC-MS/MS 法建立了一种快速、准确、高灵敏度的大鼠血浆中绿原酸含量分析方法。并将其应用于黑骨藤中绿原酸在大鼠体内的药动学研究，结果可为苗药黑骨藤的药物研发和临床合理用药提供了一定理论依据。