五味子醇甲通过调控自噬流减轻大鼠脑缺血再灌注损伤

臧 瑞， 郭 涛， 李旭华， 杨继苹， 何红云， 武煜明△， 邓仪昊△

（1云南中医药大学，2昆明理工大学，云南昆明650500）

缺血性脑卒中是大脑血液供应中断的结果，脑缺血发生后由于神经元对能量需求较高，故对葡萄糖和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的缺乏敏感，在血液供应严重受限的情况下，ATP 合成水平急剧下降但其利用仍然存在，随即细胞内离子稳态失衡，细胞膨胀、破裂［1］。脑组织及细胞的缺血损伤不仅导致梗死区域神经元死亡，而且由于突触结构局部能量衰竭，使树突功能以及神经元网络传导受损，导致周围梗死区域存活神经元的结构和功能受损［2］。缺血性脑卒中发生后3～4.5 h 内予静脉注射重组纤溶酶原激活剂治疗可减轻疾病死亡率，促进患者早期康复［3］。缺血灶的再灌注虽可避免对神经细胞造成永久性伤害，但会引起对脑组织产生包括炎症反应、细胞Ca2+超载、自由基毒性损伤、兴奋性氨基酸和NO 毒性作用在内二次损伤［4-6］。越来越多的动物实验研究试图探求缺血再灌注发生的病理机制，从而为脑缺血再灌注损伤的发生发展提供参考资料。

自噬作为一种生物过程，自噬溶酶体可对自噬产物进行有效降解并再次利用以促进新的生物合成，从而避免受损细胞发生凋亡［7-8］。脑缺血再灌注后随即发生神经元自噬，抑制自噬可增强缺血诱导的神经元损伤，而适当激活神经元自噬可以缓解缺血缺氧对脑组织造成的损伤［9-10］。自噬有复杂的分子机制，双膜囊结构的自噬体形成后将未折叠的蛋白质和受损的细胞器包裹，与溶酶体结合形成自噬溶酶体［11］。自噬激活早期微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）向自噬泡募集，通过加工形成LC3-I，活化后与自噬泡表面的磷脂酰乙醇胺结合成LC3-II，因此检测LC3-II 可提示自噬体累积［12］。但自噬体累积的原因可能是由于诱导自噬使自噬体生成增多，也可能是自噬途径阻滞导致成熟自噬体累积所致，因此需要通过对“自噬流”的分析来区分自噬体累积的具体原因是由于自噬诱导还是“自噬流”下游步骤受阻［13］。神经元自噬激活后自噬小体形成，线粒体因缺氧造成功能失调分泌泛素（ubiquitin，UB），泛素与自噬小体中P62 蛋白质结合，使受损线粒体聚集并进一步被分解代谢［14］。原溶酶体内组织蛋白酶B（cathep⁃sin B，CTSB）在溶酶体内未被激活，当自噬小体与溶酶体结合形成自噬溶酶体后，CTSB 在自噬溶酶体的酸性环境中被激活为活性酶，进而实现对自噬溶酶体内蛋白质或者细胞器的完全降解。同时，自噬溶酶体膜表面溶酶体相关膜蛋白1（lysosome-associat⁃ed membrane protein 1，LAMP1）可保护自噬溶酶体免受水解酶水解［15-16］。因此，CTSB 的蛋白质表达水平可反映自噬溶酶体水解酶激活程度，P62 与UB 的蛋白质表达水平可反映自噬溶酶体内水解酶活性，评价“自噬流”是否受阻。

五味子是“地黄饮子”、“生脉饮”等传统方剂中的主要成分之一，其中分离出的生物活性成分五味醇甲（schisandrin A，Sch A）可改善大鼠缺血性脑卒中引起的血脑屏障功能障碍，能够直接透过血脑屏障在神经细胞上发挥相应作用［17-18］。有研究报道，Sch A 可通过增加成年小鼠海马齿状回下神经干细胞的数量，促进神经元的成熟及存活［19］。同时Sch A可抑制小胶质细胞介导的炎症反应，减轻MCAO 大鼠神经元损伤［20］。此外，在对帕金森病（Parkinson disease，PD）的研究中显示，Sch A 预处理可激活神经元自噬，通过保护酪氨酸羟化酶阳性细胞，减轻炎症和氧化应激，增强神经营养活性，从而最终改善大鼠运动协调，减少运动功能障碍，实现神经保护［21］。前期我们进行的相关研究结果显示，Sch A可通过诱导MCAO 大鼠脑缺血半影区神经元自噬，对脑卒中后大鼠产生神经保护作用［22］，但Sch A的抗缺血再灌注作用是否是通过逆转自噬相关蛋白质表达、减少自噬产物堆积实现目前尚无研究。因此，本研究旨在探讨Sch A 对MCAO 大鼠产生神经保护作用的自噬机制。

材料和方法

1 材料

1.1 实验动物 选用SPF 级8 周龄健康雄性SD 大鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（湘）2019-0004，适应性饲养1周至体重达到250～280 g。

1.2 药物及主要试剂 Sch A 为纯度98.49%的白色粉末，购自Selleck，批号S382301。2%TTC 染色液（Solarbio）；抗β-actin、UB 和P62 抗体及DAPI（Cell Signaling Technology）；抗CTSB 抗体（Santa Cruz）；抗LAMP1 抗体（ABclonal）；抗LC3-II 抗体（Sigma）；抗NeuN抗体（Abcam）。

2 动物模型制备及给药

2.1 动物模型制备 参照改良Zea Longa 法［23］制作大鼠左侧大脑中动脉栓塞模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（360 mg/kg）深度麻醉，颈部正中切口，暴露左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA），活结左侧CCA 及ECA，对颈外动脉的分枝枕动脉、甲状腺上动脉和咽升动脉进行分离结扎。无创伤微血管夹夹闭ICA 主干，ECA 近心端剪开小口，插入栓线栓子后松开微血管夹，栓子穿过ICA 入颅，至栓线进入血管距离分叉处（20±1）mm 处并感轻微阻力，代表栓子已达到左侧大脑中动脉，实现左侧大脑中动脉血流阻断。90 min 后取出栓子，结扎血管，缝合术口。假手术组，大鼠麻醉后将ECA 和ICA 暴露，仅结扎ECA，不闭塞大脑中动脉，其他手术操作相同。

2.2 侧脑室注射 将10%水合氯醛注射到大鼠腹腔，待其完全麻醉后在脑立体定位仪上进行固定。剪开头部皮肤暴露颅骨，颅钻钻孔安装小螺丝。做侧脑室注射点定位：前囟后0.8～1.0 mm，正中线向左旁开1.2～1.3 mm，硬脑膜下3.8～4.0 mm。确定侧脑室注射点后钻孔埋入给药管，牙托自凝水泥包埋小螺丝及给药管。

2.3 分组及给药实验 大鼠DMSO 给药浓度可控制在10%～20%［24］，为保证安全性及足够给药剂量，以10% DMSO 为溶剂最大浓度计算Sch A 为8.62 g/L，选取8 g/L 时动物给药浓度为160 μg/kg。预实验将SD 大 鼠 分 为Sch A（160 μg·kg-1·d-1）组、10%DMSO 溶剂组与空白模型组（n=3），给药后观察7 d均未出现明显毒性作用，故确定Sch A最高给药剂量160 μg·kg-1·d-1，倍数递减中、低剂量为80 μg·kg-1·d-1和40 μg·kg-1·d-1。Sch A 各组在造模后立即予1 μL/min 的速度左侧脑室给药5 μL，给药后留针5 min，后续每天给药1次，MCAO 组大鼠每天予相同体积对照溶剂10% DMSO 左侧脑室注射，各组大鼠均给药7 d。

3 主要实验方法

3.1 神经功能损伤评分和脑组织TTC 染色 依照modified neurological severity scores（mNSS）［25］评 分法，给药7 d 后对每组6 只大鼠进行评分。进行神经功能损伤评分后麻醉处死取脑，置于-20℃冷冻20 min，在脑槽中将其切成2 mm 连续冠状切片，然后在37℃避光环境中用0.2% TTC 染液孵育30 min。染色后梗死区域呈苍白色，正常脑组织呈暗红色。ImageJ 分析软件对相关图片进行分析，计算梗死范围百分比。计算公式：脑梗死体积百分比（%）=梗死体积/对侧大脑半球体积×100%。

3.2 Western blot 分析 给药7 d 后每组随机6 只大鼠处死取脑，于冰上取其左侧脑缺血半影区组织，BCA 蛋白质测定试剂盒对各组样本蛋白质浓度进行逐一确定。调配浓度为12%的分离胶，上样后电泳分离，湿转膜法进行转膜。10%脱脂奶粉室温下封闭1 h 后选取对应分子量蛋白质条带分别封Ⅰ抗，4℃摇床孵育过夜后，TBST 洗膜3 次，用HRP 标记的Ⅱ抗稀释液封膜，室温摇床孵育1 h，TBST 洗膜3 次，ECL 化学发光底物浸泡后放入暗盒，暗室内用X 光片对条带进行压片处理。蛋白条带用ImageJ 软件处理，进行灰度值的分析。

3.3 免疫荧光双标染色 给药7 d 后每组选取6 只大鼠，使用水合氯醛完全麻醉后生理盐水心血管灌注，再用4%多聚甲醛继续灌流固定、取脑，将大脑浸入4%多聚甲醛中固定24 h，转30%蔗糖溶液中脱水。OCT 包埋剂包埋后冰冻切片机连续切片，厚度为20 μm。将切片后脑组织PBS 漂洗，浸入0.2%Triton X-100 溶液内室温透化，用PBS 进行再一次漂洗后置入浓度为10%的BSA 溶液中，在室温环境下封闭1 h，加入Ⅰ抗NeuN 和LC3-II 抗体4℃封闭过夜后用PBS 对脑片再次进行清洗。避光环境，添加荧光Ⅱ抗，室温孵育1 h，DAPI复染前PBS漂洗，最后滴加抗荧光淬灭剂。继续避光环境下荧光显微镜观察并拍照。

4 统计学处理

采用GraphPad Prism 5 软件进行实验数据的处理。以均数±标准误（mean±SEM）表示。选用单因素方差分析（one-way ANOVE）对各组中得到的数值进行评估比较，两组之间测量变量差异用Newman-Keuls 检验评估。以P＜0.05 为组间差异有统计学意义。

结 果

1 五味子醇甲对MCAO 大鼠神经功能缺损评分的影响

mNSS 评分结果显示，sham 组大鼠没有出现神经功能方面的缺损，而MCAO 组损伤症状明显，其mNSS 评分较sham 组显著升高。与MCAO 组相比，Sch A 各剂量组神经功能损伤症状减轻，mNSS 评分显著降低（P＜0.05或P＜0.01），且各治疗组中神经功能损伤评分随Sch A 的给药剂量增加而呈逐渐下降趋势，其中Sch A（40 μg·kg-1·d-1）和Sch A（80 μg·kg-1·d-1）组间无显著差异（P＞0.05），见图1。

2 五味子醇甲对MCAO大鼠脑梗死体积的影响

Figure 1. Effects of Sch A on neurological deficit score in rats with cerebral I/R injury. Mean±SEM. n=6.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO group；△P＜0. 05 vs 40 and 80 μg/kg Sch A group.图1 Sch A对MCAO大鼠神经功能缺损评分的影响

TTC 染色结果显示，MCAO 大鼠出现白色脑梗死区域，经Sch A 治疗后，各治疗组白色脑梗死区域体积缩小；各组脑梗死体积数据的统计学分析结果表明，Sch A 治疗7 d 后，与MCAO 组大鼠相比，Sch A 各剂量组大鼠脑梗死区域体积显著减少（P＜0.05或P＜0.01），但Sch A（40 μg·kg-1·d-1）和Sch A（80 μg·kg-1·d-1）组无显著差异（P＞0.05），见图2。

Figure 2. Effects of Sch A on the infract volume in rats with cerebral I/R injury（TTC staining）. Mean±SEM. n=6. **P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO group；△P＜0.05 vs 40 and 80 μg/kg Sch A group.图2 Sch A对MCAO大鼠脑梗死体积的影响

3 五味子醇甲对MCAO 大鼠脑缺血半影区自噬流相关蛋白的影响

Western blot 统计结果显示，与sham 组相比，MCAO 组大鼠脑皮层中P62 和UB 蛋白表达量升高（P＜0.05），CTSB 蛋白表达量降低（P＜0.05）；经Sch A 治疗7 d 后，与MCAO 组相比，Sch A 低剂量组P62蛋白表达水平无统计学差异（P＞0.05），P62 蛋白表达水平在中、高剂量组均显著降低（P＜0.05），各治疗组UB 蛋白表达量降低（P＜0.05），而CTSB 蛋白表达量升高（P＜0.05），均以Sch A 高剂量组的蛋白质表达量变化最为显著；MCAO 组LAMP1 的蛋白质表达量较sham 有降低趋势，用药后Sch A 各治疗组较MCAO 组LAMP1 的蛋白质表达量有增加趋势，但所有组别间无显著差异（P＞0.05），见图3。

4 五味子醇甲对MCAO 大鼠脑缺血半影区神经元自噬表达的影响

Figure 3. Effects of Sch A on expression of autophagic flux-related proteins after MCAO. The protein levels of P62，ubiquitin（UB），lysosome-associated membrane protein 1（LAMP1）and cathepsin B（CTSB）in the cortex of each group were evaluated by Western blot analysis. Mean±SEM. n=6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；△P＜0.05 vs MCAO group；#P＜0.05 vs 80 μg/kg Sch A group.图3 Sch A对MCAO大鼠脑缺血半影区自噬流相关蛋白表达的影响

免疫荧光双标结果提示，大鼠脑缺血半影区神经元上出现LC3-II 的自噬活性表达。与sham 组相比，MCAO 组LC3-II 表达阳性的神经元比例显著升高（P＜0.01）；Sch A 治疗7 d 后与MCAO 组相比，LC3-II 表达阳性的神经元比例增加（P＜0.05 或P＜0.01），且与Sch A 低剂量及中剂量组相比，Sch A 高剂量组LC3-II 表达阳性的神经元比例升高显著（P＜0.05），见图4。

讨 论

Sch A 具有多种药理活性，是中药五味子中的有效成分。以往研究表明，在MCAO 大鼠缺血24 h 后Sch A 可使神经元在急性缺血缺氧损伤中存活，减少由缺血性脑损伤引起的神经功能障碍，同时逆转了氧糖剥夺损伤引起的细胞死亡。这种神经保护作用与Sch A 调节AMPK/Nrf2 通路抑制炎症细胞因子释放，增加抗炎细胞因子浓度有关，通过抑制神经元的氧化应激，减少坏死神经元的数量实现神经保护［26］。

Figure 4. LC3-II expression positive neurons determined by immunofluorescence（scale bar=50 μm）. Autophagic cells were stained with LC3 antibody（red）. Neurons were stained with NeuN antibody（green）. Cell nuclei were visualized by DAPI（blue）.Mean±SEM. n=6. **P＜0.01 vs sham group；△P＜0.05 vs MCAO group；#P＜0.05 vs 80 μg/kg group.图4 Sch A对MCAO大鼠脑缺血半影区神经元自噬的影响

大鼠脑缺血再灌注发生后，为减轻缺氧缺血引起的神经元坏死及脑损伤，通过PI3K-Akt 轴增加神经元自噬发生可使beclin-1 和LC3-II 的表达升高［27-28］。我们前期研究表明，Sch A 可促进神经元be⁃clin-1 和LC3-II 的蛋白质表达水平从而增加自噬过程［22］。自噬激发后相较于本底水平自噬小体生成量增加，与溶酶体结合后生成自噬溶酶体，进一步促进自噬底物的降解，而自噬溶酶体融合障碍或自噬溶酶体功能障碍时“自噬流”受阻也可引起自噬小体的累积增多［29］，以上情况均可导致LC3-II 的表达增加，因此单独的LC3-II 的表达升高并不一定提示“自噬流”的通畅，需结合自噬流降解蛋白质的水平变化综合分析。CTSB 是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，在酸性环境中可激发其活性，当溶酶体内PH 值下降或自噬溶酶体形成后，CTSB被激活降解包裹蛋白质或细胞器［30］。LAMP1 是自噬溶酶体膜上的标志性蛋白，随着自噬启动自噬溶酶体形成增多，LAMP1 及CTSB 的表达也应随之增加。同时，自噬溶酶体形成后会完成对自噬底物的包裹与分解，故使P62 与UB表达减少。本实验Western blot 结果提示Sch A 处理后各剂量组大鼠脑缺血半影区LAMP1 蛋白质表达量仅有上升趋势，但并未表现出统计学差异。考虑LAMP1 虽然是自噬溶酶体膜上的标志性蛋白质，但其特异性不高，可存在于溶酶体、自噬体等多种细胞器膜上，所以单纯检测LAMP1 的表达升高或降低并不能够判断神经元溶酶体或自噬溶酶体的存在［31］。大鼠脑缺血再灌注后LAMP1 表达降低可能是由于缺血半影区细胞死亡引起，给药后随着神经保护作用的产生，存活细胞及其内细胞器增多，故出现LAMP1 表达水平升高的趋势。与sham 组对比，MCAO 组CTSB 低表达提示此时大鼠脑缺血半影区自噬溶酶体水解酶活性低，P62 及UB 的表达量增加则是由于自噬溶酶体水解酶活性降低导致的自噬底物堆积引起。与MCAO组比较，Sch A不同浓度处理7 d 后CTSB 表达水平提高，对应P62 及UB 蛋白质表达水平下降，提示Sch A处理后逆转大鼠缺血半影区自噬相关蛋白质表达，溶酶体水解酶活性提高，自噬底物被进一步分解，此作用在Sch A高剂量组更为显著。免疫荧光双标法做细胞定位，结果表明，与sham组相比，MCAO 组大鼠缺血半影区LC3-II蛋白表达，且此表达主要呈现于神经元，提示大鼠脑缺血再灌注后自噬小体的形成主要发生于神经元。Sch A 处理后各剂量组LC3-II 表达呈阳性的神经元比例增加，提示Sch A 增加了MCAO 大鼠神经元自噬小体的表达。结合Western blot 结果，自噬发生后自噬溶酶体内水解酶活性提高进一步分解自噬底物，因此神经元自噬小体的增加并不是自噬底物堆积或自噬流的阻断引起，而是由于Sch A处理后增加了神经元的自噬诱导，随着自噬流的进行，自噬小体增加随之增多。脑缺血和再灌注损伤均可导致神经元受损，而神经学评分及脑梗死体积是评估大鼠脑损伤的具体标志［32］。结合本实验mNSS 评分及TTC 染色结果，Sch A 处理后降低大鼠mNSS 评分，减少缺血梗死体积，且表现出较好的剂量依赖性。综合以上资料表明，Sch A 具有较好的抗缺血再灌注损伤的作用，其机制可能与神经元自噬相关。

综上所述，我们的数据表明，Sch A 处理MCAO大鼠后可逆转其缺血半影区CTSB、P62及UB表达水平，减少自噬产物堆积而产生抗脑缺血再灌注损伤的作用，其机制可能与神经元自噬相关。Sch A 虽然在多种神经系统疾病中表现出良好的神经保护作用，但对MCAO 大鼠神经元自噬的影响研究较少。自噬是一个动态的细胞生物过程，单纯从此过程中部分蛋白的升高或降低不足以判读自噬流的增强或减弱，因此在目前研究基础上选择适当的自噬阶段及相对应的诱导剂或抑制剂干预，以探究Sch A 对MCAO 大鼠神经元自噬的影响是我们下一步将深入探讨的课题。