阿片类生长因子受体抑制雄激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞的生长*

张志发， 朱梦娇， 周志强， 王学仁

（华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科，湖北武汉430030）

前列腺癌是成年男性常见的恶性肿瘤之一，其生长和功能高度依赖雄激素，雄激素水平愈高，细胞的增殖能力也愈强［1］。雄激素剥夺治疗、抗雄激素等相关治疗是目前的主要治疗手段。但随着病程的延长，绝大多数雄激素依赖性前列腺癌最终都会进展为雄激素非依赖性前列腺癌，导致后期治疗效果不佳。因此，深入研究雄激素在前列腺癌中的功能对了解前列腺癌的发病机制至关重要。阿片类生长因子受体（opioid growth factor receptor，OGFr）是内源性阿片类肽OGF 的特异性受体，与其他经典的阿片类受体无结构上的同源性［2］。OGFr 在正常表皮细胞［3］及肿瘤细胞［4］中均有表达，在调节伤口愈合、细胞增殖、血管形成以及细胞周期等方面发挥着重要作用［5-7］。近期Yu 等［8］研究证实，在雄激素依赖的人前列腺癌LNCaP 细胞增殖过程中OGFr表达下调，但对OGFr 是否参与了LNCaP 细胞增殖过程及发挥何种功能尚不清楚。因此，本研究拟通过体外构建高表达OGFr 的LNCaP 细胞模型，初步探讨OGFr 在雄激素诱导LNCaP 细胞增殖过程中的作用及可能的分子机制。

材料和方法

1 材料

LNCaP 细胞系购自中科院上海细胞生物医学研究所。DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和青-链霉素（Hyclone）；二氢睾酮（dihydrotestosterone，DHT）、Trizol 和RIPA 裂解液（Sigma）；逆转录试剂盒和KOD SYBR®qPCR Mix（TOYOBO）；真核表达质粒pcDNA3.1-OGFr 及pcDNA3.1 空白质粒（Ambion）；LipofectamineTM2000 Reagent和Opti-MEM I还原型血清培养液（Gibco）；CCK-8 试剂盒（Sigma）；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒和细胞周期试剂盒（江苏凯基生物技术有限公司）；鼠抗人细胞周期蛋白依赖性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）、细胞周期蛋白E（cyclin E）和p21 抗体（Santa Cruz）；兔抗人OGFr 抗体（Sigma）；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠和羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；内参照β-actin抗体（武汉博士德有限公司）。

2 方法

2.1 细胞转染及实验分组 LNCaP 细胞用含10%FBS、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 链霉素的DMEM培养液，在37℃、5% CO2、饱和湿度的培养条件下常规培养。选取对数生长期的细胞接种于6 孔板，待融合度达到80%以上，更换为500 μL 不含FBS 的OPTI-MEM I 培养液，按照转染试剂LipofectamineTM2000 说明书分别加入预先制备的pcDNA3.1 空白质粒和pcDNA3.1-OGFr 重组质粒分别与脂质体的复合物，记为阴性对照组和pcDNA3.1-OGFr 质粒组，非转染（nontransfection，NT）组加入等体积的OPTIMEM I 培养液。孵育6 h 后更换为DMEM 完全培养液，48 h 后加入300 mg/L G418 筛选试剂。2 周后出现单细胞克隆，挑选单克隆扩增后进行后续实验。

2.2 RT-qPCR 收集不同组细胞，用Trizol 试剂提取RNA，添加DEPC 水将RNA 溶解，紫外分光光度计测定A260/A280比值合格（1.8～2.0 之间）后，置于-80℃保存备用。按照cDNA 合成试剂盒步骤逆转录合成cDNA，逆转录条件为：37℃30 min，50℃2 min，98℃5 min。取1 μL cDNA，分别加入KOD SYBR®qPCR Mix、引物及去离子水，冰浴中配制20 μL 反应体系：去离子水7 μL，KOD SYBR®qPCR Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 模板1 μL。反应条件为：95℃预变性60 s；95℃变性10 s，60℃退火60 s，循环40 次。所有样品均按照3 个复孔进行实验。所用引物序列见表1［9-10］。结果按照2-ΔΔCt法计算，数值代表实验组目的基因的表达水平是对照组的2-ΔΔCt倍，以GAPDH作为内参照。

表1 RT-qPCR所用引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

2.3 CCK-8 法检测细胞活力 将对数生长期细胞制成细胞悬液，以每孔5×103个的密度接种于96孔板中常规培养，每孔100 μL。待细胞贴壁后向各孔中加入终浓度为10 nmol/L 的DHT，按照DHT、DHT+pcDNA3.1 和DHT+pcDNA3.1-OGFr 分 组，control 组加入同体积培养液。DHT分别作用24、48、72和96 h后加入10 μL CCK-8 溶液，37℃孵育1 h。用酶标仪检测各孔在450 nm 处吸光度（A），再计算细胞活力。实验每组设置5个复孔，重复3次并取平均值。细胞活力（%）=（实验组A 值-空白组A 值）/（对照组A 值-空白组A值）×100%。

2.4 细胞周期与凋亡检测 取对数生长期的细胞以每孔2×105个的密度接种于6 孔板，按照DHT、DHT+pcDNA3.1 和DHT+pcDNA3.1-OGFr 分组。按细胞周期检测试剂盒推荐步骤操作：消化收集细胞，用预冷PBS缓冲液重悬、洗涤细胞，加入1 mL预冷的70%乙醇，4℃固定过夜；离心弃上清，加入预先配制的RNase A/PI 染色工作液，37℃避光染色30 min；用流式细胞仪检测细胞周期分布。使用Annexin Ⅴ-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒检测不同时间点细胞的凋亡：细胞经胰酶消化、离心，调整细胞密度并制备单细胞悬液，加入5 μL 细胞凋亡检测试剂Annexin Ⅴ-FITC，混匀后加入10 μL PI 试剂，避光、室温孵育10 min；用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.5 Western blot 实验 收集不同组的细胞加入适量的RIPA 全裂解液裂解，提取细胞总蛋白，利用BCA 试剂盒测定蛋白浓度。在细胞总蛋白样品中加入loading buffer，沸水使其充分变性。然后用SDSPAGE 分离蛋白，经蛋白转膜、封闭、Ⅰ抗（OGFr 抗体、CDK2 抗体和cyclin E 抗体均1∶500 稀释，p21 抗体1∶1 000稀释）及Ⅱ抗孵育杂交后进行ECL 化学发光反应。以β-actin为内参照，对条带进行灰度扫描，比较目的蛋白的相对表达水平。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析处理。数据以均数±标准差（mean±SD）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），进一步多重比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 重组质粒pcDNA3.1-OGFr 转染上调OGFr 在LNCaP细胞中的表达

RT-qPCR 和Western blot 检测结果显示，与非转染组（NT 组）和阴性对照组（pcDNA3.1 组）比较，pcDNA3.1-OGF组OGFr的mRNA和蛋白表达显著增加（P＜0.05），见图1。

Figure 1. The mRNA（A）and protein（B）expression of OGFr in the LNCaP cells transfected with pcDNA3.1-OGFr was determined by RT-qPCR and Western blot，respectively. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs pcDNA3.1 group or NT group.图1 LNCaP细胞中OGFr的mRNA和蛋白表达

2 转染pcDNA3.1-OGFr可抑制DHT对LNCaP细胞活力的作用

与control 组相比，10 nmol/L DHT 可呈时间依赖性的促进LNCaP 细胞活力（P＜0.05）；与空白对照组（DHT 组）相比，在10 nmol/L DHT 作用72 h 和96 h后，pcDNA3.1-OGFr 转染组LNCaP 细胞的增殖能力受到显著抑制（P＜0.05），见图2。后续实验选取10 nmol/L DHT处理LNCaP细胞72 h为研究时点。

3 过表达OGFr 的LNCaP 细胞在DHT 作用下发生G0/G1期阻滞，但凋亡不受影响

Figure 2. The effect of DHT on the viability of LNCaP cells was inhibited by pcDNA3.1-OGFr plasmid transfection at different time points（72 and 96 h）. Mean±SD. n=3.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs DHT group.图2 OGFr抑制DHT对LNCaP细胞活力的作用

流式细胞术检测10 nmol/L DHT 作用于LNCaP细胞72 h 后细胞周期及凋亡的变化。细胞周期检测结果表明，相对于DHT 组，DHT+pcDNA3.1-OGFr组LNCaP 细胞在G0/G1期细胞百分比显著升高［（70.3±7.5）% vs（51.7±5.1）%，P＜0.05］，S 期比例显著降低［（13.5±3.3）% vs（34.2±2.7）%，P＜0.05］，见图3；细胞凋亡检测结果表明，相对于DHT组，DHT+pcDNA3.1-OGFr 组LNCaP 细胞凋亡率无显著差异［（8.3±1.7）% vs（5.6±1.1）%，P＞0.05］，见图4。

4 过表达OGFr 导致的细胞周期阻滞与CDK2 和p21的表达有关

相对于control 组，10 nmol/L DHT 作用72 h 可上调LNCaP 细胞CDK2 的mRNA 和蛋白表达，同时下调p21 的mRNA 和蛋白表达（P＜0.05），而cyclin E 表达无显著差异；相对于DHT 组，DHT+pcDNA3.1-OGFr 转染组CDK2 的mRNA 和蛋白表达水平显著降低，p21 的mRNA 和蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），而cyclin E表达无显著差异，见图5。

Figure 3. Over-expression of OGFr in LNCaP cells resulted in G0/G1 phase arrest in the presence of DHT. After treatment with 10 nmol/L DHT for 72 h，the cell cycle of the LNCaP cells transfected with pcDNA3.1-OGFr was evaluated by flow cytometry.Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs DHT+pcDNA3.1 group or DHT group.图3 过表达OGFr导致DHT处理的LNCaP细胞发生G0/G1期阻滞

Figure 4. Over-expression of OGFr had no effect on DHT-induced LNCaP cell apoptosis. The apoptosis of the LNCaP cells trans⁃fected with pcDNA3.1-OGFr and treated with 10 nmol/L DHT for 72 h was measured by flow cytometry. Mean±SD. n=3.图4 过表达OGFr与DHT引起的LNCaP细胞凋亡无关

Figure 5. The mRNA（A）and protein（B）expression of CDK2 and p21 in LNCaP cells promoted by DHT was partly reversed by overexpression of OGFr. The mRNA and protein expression levels of CDK2，cyclin E and p21 in the LNCaP cells transfected with pcDNA3.1-OGFr and treated with 10 nmol/L DHT for 72 h were determined by RT-qPCR and Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs DHT group；#P＜0.05 vs control group.图5 过表达OGFr可部分逆转DHT对LNCaP细胞CDK2和p21 mRNA和蛋白表达的刺激作用

讨 论

OGFr 是OGF 抑制细胞增殖的特异性受体，抑制或敲除OGFr 可促进细胞的增殖［11-12］。本研究将pcDNA3.1-OGFr 重组质粒转染LNCaP 细胞，发现LNCaP 细胞中存在OGFr 的表达，转染pcCDNA3.1-OGFr 重组质粒可进一步增加细胞中OGFr 表达水平，说明pcDNA3.1-OGFr 重组质粒成功转入细胞，并可上调OGFr 蛋白的表达。Zagon 等［13］证实高表达OGFr 可抑制胰腺癌细胞的增殖，本研究也观察到转染重组OGFr 表达质粒可显著抑制DHT 对LNCaP 细胞活力的促进效应，提示OGFr可能参与了DHT调控LNCaP 细胞增殖的过程，但目前对其如何在胞核或胞质内与雄激素受体“互话”而影响LNCaP 细胞的增殖尚不清楚，需要进一步研究以及动物实验验证。

细胞周期紊乱或凋亡增加可导致细胞增殖抑制。本研究证实OGFr 可引起DHT 处理的LNCaP 细胞出现细胞周期阻滞，与Zagon 等［13］研究显示OGFr的活化引起肿瘤细胞发生G0/G1期阻滞结论一致，其原因可能与OGFr 的表达上调增加了其与特异性配体OGF 的结合位点有关。细胞发生G0/G1期阻滞多与G1/S 期检测点通过受限有关，而CDK2、cyclin E 以及CDK 的抑制剂p21 是G1期进入S 期的关键调控因子［14-15］。本研究提示，在雄激素DHT 的刺激下，高表达OGFr可部分逆转DHT 对p21和CDK2 mRNA 和蛋白表达的影响，它与胰腺癌［16］中OGFr 调节细胞周期阻滞的方式相似，却与OGFr 在正常细胞中通过p21/p16［3］或甲状腺癌细胞通过p16［17］调节细胞周期并抑制增殖的机制不同，但以上结果均表明OGFr 主要通过CDK抑制因子调节细胞周期。

此外，我们也检测了OGFr对LNCaP 细胞凋亡的影响，结果显示过表达OGFr对DHT处理的细胞凋亡率并无影响。目前关于OGFr 是否可引起细胞凋亡尚无定论。Wang 等［18］证实OGFr 可导致胃癌细胞发生凋亡；而我们的研究结果与Campbell 等［19］的报道相似：OGFr 的表达与细胞凋亡无关，分析其原因可能与肿瘤细胞的来源差异有关。

总之，人前列腺癌LNCaP 细胞在雄激素DHT 刺激下出现增殖效应的过程中，OGFr基因表现出类似抑癌基因在肿瘤发生发展过程中受抑制的特性。但本研究仅仅观察了DHT 作用下OGFr 对细胞活力的影响，并未涉及OGFr 对LNCaP 细胞的直接作用；另外，本研究以单一的细胞系作为研究对象，其实验结果还需要体内、体外实验的进一步验证。因此，后续的研究应从分子水平及动物层面研究不同来源、不同特性的前列腺癌细胞中OGF、DHT 与OGFr的作用方式，以期为阐明前列腺癌的发生发展机制提供实验依据。