高效液相色谱法测定复方桐叶烧伤油中熊果酸和齐墩果酸的含量

杨德泉，徐玉辉，覃爱桃，韩湘云

1.湘西土家族苗族自治州食品药品检验所，湖南 吉首 416000；2.湘西宏成制药有限责任公司，湖南 吉首 416000

复方桐叶烧伤油收载于《国家药品标准新药转正标准》第77 册［1］，由桐叶和麻油组成，具有清热解毒，消肿止痛，祛腐生肌的功效，用于面积小于29%的烧烫伤。其中，桐叶为玄参科植物白花泡桐Paulownia fortunei（Seem.）Hemsl.的干燥叶。桐叶含有熊果酸、3α-羟基-熊果酸、23-羟基-乌苏酸、2α,3β,19,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸、2α,3α,23-三羟基-12-烯-28-乌苏酸、2α,3β,19,23-四羟基-12-烯-28-乌苏酸、齐墩果酸、2α-羟基-齐墩果酸（山楂酸）、19α-羟基-乌鸽苏酸、木樨草素、洋芹素、β-谷甾醇、棕榈酸、落叶酸、胡萝卜苷、2α,3β,19β-三羟基-乌苏酸-28-O-β-D-吡喃半乳糖苷、3β,28-二羟基-乌苏烷等成分［2-6］。其中熊果酸含量居首［7］。麻油为脂麻科植物脂麻Sesamum indicumL.的成熟种子用压榨法得到的脂肪油，主要为不饱和脂肪酸、蛋白质、木脂素类等成分。熊果酸和齐墩果酸为一对物理、化学性质极为相近的同分异构体，常同时存在于某一植物中。严华等［8］建立了原位预处理-薄层色谱法，成功分离了熊果酸和齐墩果酸。杨德泉等［9］应用原位预处理-薄层色谱法，分离了桐叶中的熊果酸、齐墩果酸。复方桐叶烧伤油标准中的含量测定采用薄层色谱扫描方法测定熊果酸的含量，所测定的熊果酸实际为熊果酸与齐墩果酸的混合物。由于薄层色谱扫描法受环境的温度、湿度以及个人的操作技能水平的影响较大，方法的重现性较差［10］，本研究在相关文献报道［11-19］及法定标准［20-21］的基础上，建立了高效液相色谱（HPLC）法测定复方桐叶烧伤油中熊果酸和齐墩果酸两个成分的含量方法。结果表明，该方法简单、快速、准确、灵敏、稳定，可用于复方桐叶烧伤油的质量控制。

1 仪器、试药和样品

1.1 仪器

岛津LC-20AT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司），色谱柱YMC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，编号HS12S05-2546WT，YMC 公司）；安捷伦液相色谱仪Agilent 1260［Agilent 科技（中国）有限公司］，色谱柱Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，PN：588905-902，Agilent 公司）；CS-9301 型双波长薄层扫描仪（日本岛津公司）；定量毛细管（美国Orunond Scientigic Co）；电子天平：AB135-S（METTLER TOLEDO，十万分之一）；超声波清洗器（型号：KQ-3008，昆山美美超声仪器有限公司）；多试管涡旋混合器（Multi-Tube Vortexer UMV-2)；离心机（Centrifuge 5810R，Eppendorf AG）。

1.2 试药和样品

熊果酸（中国食品药品检定研究院，批号：110742-201823，使用前不需要干燥处理，供含量测定用，含量以99.9%计），齐墩果酸（中国食品药品检定研究院，批号：110709201808，使用前不需要干燥处理，供含量测定用，含量以91.1%计）。乙腈、甲醇为色谱纯，水为纯净水，其余试剂为分析纯。7 批复方桐叶烧伤油样品，由湘西宏成制药有限责任公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液（61∶18∶21）；流速：1 mL/min；检测波长为210 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取熊果酸对照品49.81 mg、齐墩果酸对照品13.85 mg，置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为熊果酸和齐墩果酸的标准贮备溶液，浓度分别为0.995 2 mg/mL 和0.252 3 mg/mL。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取样品5 mL，置50 mL 离心管中，加入10 mL 甲醇，涡旋混匀5 min，超声（200 W、40 kHz）5 min，5 000 r/min 离心5 min，取上层甲醇液；下层液另加10 mL 甲醇，如前操作；下层液再加甲醇5 mL，如前操作。合并上层甲醇液于25 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。置-18 ℃放置30 min，取出，过0.22 μm 滤膜，为供试品溶液。

2.4 系统适用性试验

取“2.2”项下溶液，按“2.1”色谱条件测定，色谱峰的理论板数和分离度均符合要求。取“2.3”项下溶液测定，供试品色谱中，在与对照品色谱峰相应位置上检出色谱峰。对照品、供试品色谱图见图1、图2。

图1 混合对照品色谱图：

图2 复方桐叶烧伤油液相色谱图：

2.5 线性关系考察

精密吸取“2.2”项下标准贮备溶液0、0.5、1.0、3.0、4.0、6.0、10.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，制成为每mL 含熊果酸0、0.049 76、0.099 52、0.298 6、0.398 1、0.597 1、0.995 2 mg，含齐墩果酸0、0.012 61、0.025 23、0.075 69、0.100 9、0.151 4、0.252 3 mg 的溶液，摇匀，即得系列对照品溶液。

分别精密吸取上述系列对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析，以进样量X（mg/mL）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归处理，得熊果酸的回归方程：Y=4 686.574 2X-6.525 9，r=0.999 9；齐墩果酸的回归方程：Y=5 273.108 2X+1.175 9，r=0.999 9。结果表明，熊果酸在0.497 6～9.952 μg/mL、齐墩果酸在0.126 1～2.523 μg/mL 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验

取同一浓度对照品溶液，连续进样6 次，熊果酸峰面积的RSD=0.21%，齐墩果酸峰面积的RSD=0.19%，表明仪器精密度好。

2.7 重复性试验

取批号20201106 的样品6 份，制备成供试液，分别按样品测定法测定。熊果酸含量分别为1.166 4、1.151 3、1.141 3、1.120 7、1.143 2、1.158 6 mg/mL，平均含量为1.146 9 mg/mL，RSD=1.59%。齐墩果酸含量分别0.321 7、0.322 6、0.321 9、0.329 9、0.333 3、0.329 3 mg/mL，平均含量为0.326 4 mg/mL，RSD=0.50%，表明该方法重复性良好。

2.8 耐用性试验

分别用液相色谱仪（1）Agilent 1260 Ⅱ，色谱柱Agilent C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm，编号588905-902，Agilent 公司）和（2）LC-20AT，色谱 柱YMC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，编 号HS12S05-2546WT，YMC 公司），理论塔板数按熊果酸计，均能达到5 000 以上，熊果酸含量测定值RSD 为0.20%，齐墩果酸含量测定值RSD 为0.30%。结果表明，本方法耐用性良好。

2.9 稳定性试验

取同一供试品溶液（批号：20180601），于0、1、2、4、8、12、24 h，进样测定峰面积，结果熊果酸RSD=1.30%，齐墩果酸RSD=0.44%，表明在24 h内基本稳定。

2.10 加样回收率试验

取样品3 mL（批号：20201105，已测得3 mL中含熊果酸2.195 4 mg、齐墩果酸0.788 7 mg）6 份，分别按已测得含量的80%、100%、120%，对应加入熊果酸对照品1.791 4、2.239 2、2.687 0 mg，齐墩果酸对照品0.451 4、0.557 7、0.681 2 mg，按供试液制备方法制备成为供试液，按“2.1”项下色谱条件测定，平均加样回收率结果见表1、表2。

表1 熊果酸加样回收试验结果

表2 齐墩果酸加样回收实验结果

2.11 TLCS 法与HPLC 法测定样品中熊果酸含量比较

取复方桐叶烧伤油样品7 批，分别按复方桐叶烧伤油标准含量测定方法（TLCS 法）和按“2.1”项下方法测定熊果酸含量。表3 结果显示，HPLC法测定样品中熊果酸含量，高于TLCS 法所测含量2.8～5.6 倍。

表3 TLCS法与HPLC法测定样品中熊果酸含量表

2.12 样品含量测定

精密量取样品5 mL，置50 mL 离心管中，加入10 mL 甲醇，涡旋混匀5 min，超声5 min，5 000 r/min离心5 min，取上层甲醇液；下层液另加10 mL 甲醇，如前操作；下层液再加甲醇5 mL，如前操作。合并上层甲醇液于25 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。置-18 ℃放置30 min，取出，过0.22 μm 滤膜，为供试液。按“2.1”项下色谱条件进样检测，测定熊果酸和齐墩果酸的峰面积，用回归方程计算熊果酸、齐墩果酸的含量。7 批样品含量测定结果见表4。

表4 复方桐叶烧伤油中熊果酸和齐墩果酸的含量

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

流动相选择乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液（67∶12∶21）和乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液（61∶18∶21）。乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液（67∶12∶21）出峰时间较短，约11 min，但分离度小于1.5；乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液（61∶18∶21）较为合适，熊果酸出峰时间约为13 min，分离度1.6，与其他成分完全分离。

3.2 供试品溶液的制备

复方桐叶烧伤油为油剂，在供试溶液的制备中除去麻油所含油脂、蛋白质、甘油酯等成分是技术关键。本实验用乙醇和甲醇为提取溶剂、用200 W/40 kHz 和300 W/40 kHz 超声条件提取，比较了对熊果酸和齐墩果酸提取效率的影响，最终选择甲醇为溶剂，超声条件为200 W/40 kHz，经涡旋混匀→超声→离心提取处理后，将获得的甲醇提取液定容，置-18 ℃放置30 min 以除去甘油酯等杂质，取出，过0.22 μm 滤膜，制备为供试品溶液。HPLC 色谱图显示，在熊果酸峰和齐墩果酸峰部位无杂质干扰，熊果酸与齐墩果酸的色谱峰分离效果好。

本研究中色谱条件的线性关系、重复性、稳定性、加样回收率、耐用性均良好，方法可行。复方桐叶烧伤油中熊果酸和齐墩果酸分离度均大于1.5，与其他成分完全分离，为控制该制剂质量提供了可靠的方法。