外源NO对低温胁迫下伏毛铁棒锤种子萌发及幼苗生理特性的影响

茹 刚，陈学林，于文惠，张桃桃

(西北师范大学 生命科学学院，甘肃 兰州 730070)

伏毛铁棒锤(AconitumflavumHand.-Mazz.)为毛茛科乌头属多年生草本植物，又名断肠草、一枝蒿等，生长在海拔2 000～3 700 m山地草坡或疏林下，主要分布于甘肃、青海及宁夏南部等。伏毛铁棒锤是藏族习用地道药材，收录于《中华人民共和国卫生部药品标准(藏药)》(第一册)[1]。其块根有剧毒，加工后可供药用，主治跌打损伤、风湿性关节痛等症。其药用价值很高，对肿瘤也有一定疗效，有很好的镇痛作用，比吗啡药效强约50倍并不具成瘾性[2]。目前伏毛铁棒锤的使用价值不仅体现在医疗领域，其有效成分生物碱还是杀虫剂的重要组分，张玉粉[3]探究了伏毛铁棒锤生物碱对化学农药毒杀力度的影响，结果显示伏毛铁棒锤生物碱和高效氯氟氰菊酯(betacyfluthrin)混配表现出较强的增效作用。此外，伏毛铁棒锤花序长而丰满，呈紫色或暗紫色，花期为8-9月，具有较高的园林观赏价值。

低温是限制植物种子萌发及幼苗生长发育的非生物胁迫因子之一，低温不仅会引起植物茎叶形态的改变，还会使植株的正常新陈代谢紊乱，低温超过耐受范围甚至会造成植物体的死亡[4]。我国大面积早春冻害(又称倒春寒)时有发生。据白城市气象站23年的气象记录，4月上中旬地面气温低于-10 ℃的概率为22%，可见发生“倒春寒”的概率很高；2001年呼伦贝尔曾有4 000 hm2的紫花苜蓿由于受到寒流的侵袭导致大面积死亡，给当地牧民的经济收入造成了巨大损失[5]。在我国北方地区，伏毛铁棒锤幼苗也常受到低温的胁迫，所以提高伏毛铁棒锤幼苗的抗寒性势在必行。

目前，有关外源NO对低温胁迫下伏毛铁棒锤种子萌发和幼苗生理学特性的影响鲜有报道。为此，本研究以伏毛铁棒锤种子和幼苗为材料，探讨外源NO对低温胁迫下伏毛铁棒锤幼苗膜系统稳定性、抗氧化酶活性、渗透调节物质及叶绿素含量的影响，旨在丰富外源NO对逆境胁迫下药用植物影响的理论研究，为提高伏毛铁棒锤幼苗的抗寒性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验所用种子于2018年9月采自甘肃省景泰县老爷庙(103°49′19″ N,37°04′02″ E)，由陈学林教授鉴定为伏毛铁棒锤种子。伏毛铁棒锤种子在4 ℃下湿砂层积40 d破除休眠后，在SPX-150-GB型光照培养箱中培养萌发。外源NO供体硝普钠(SNP)购自天津市北辰方正试剂厂。

1.2 方 法

1.2.1 低温胁迫下种子发芽率、发芽势、活力指数的测定 取大小均匀、饱满干燥的伏毛铁棒锤种子(50粒为1组)，在外源NO供体硝普钠(SNP)浓度分别为0(对照,CK)，50，100，150，200，250，300 μmol/L的溶液中浸种24 h，每组处理3个重复。24 h后将种子置于覆有双层滤纸直径9 cm的培养皿中，以伏毛铁棒锤种子最佳萌发温度15 ℃为对照[9]，分别在8，4 ℃下置于SPX-150-GB型光照培养箱中培养萌发(光强：4 000 lx，相对湿度：85%，光周期：10 h黑暗/14 h光照)。并定时向培养皿中加对应溶液以确保滤纸湿润，随时观察种子萌发情况，以胚芽生长长度为种子长度的1/2为萌发标准。参照刘维宝等[10]的方法，在第1粒种子萌发后每天统计发芽率，测量根长并计算活力指数。

萌发率=第30天正常发芽的种子数/供试种子数×100%。

萌发势=第18天正常发芽的种子数/供试种子数×100%。

活力指数=∑Gt/Dt×Ls。其中，Dt为相应发芽时间，Gt为Dt时间内的出芽种子数，Ls为根长。

1.2.2 伏毛铁棒锤幼苗的培养及处理 由于4 ℃低温下伏毛铁棒锤种子萌发率较低，出苗率达不到后续试验所需，故选择15 ℃下培养的伏毛铁棒锤幼苗。当幼苗长出2片真叶后，在其叶面定时喷施50，100，150，200，250，300 μmol/L SNP溶液，每天1次，以蒸馏水处理为对照。3 d后将处理幼苗置于4 ℃ SPX-150-GB型光照培养箱中进行低温胁迫试验，每隔24 h测定幼苗相关生理指标，连续测3 d。第三天后，测定4 ℃胁迫未经缓解及4 ℃胁迫后经200 μmol/L SNP缓解过的伏毛铁棒锤幼苗的叶绿素(a+b)含量，并观察其表型特征，以上述15 ℃培养的伏毛铁棒锤幼苗为对照。

1.2.3 伏毛铁棒锤幼苗生理指标的测定 超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性测定采用程艳等[11]的方法；丙二醛(MDA)含量测定采用2-硫代巴比妥酸法[12]；过氧化氢(H2O2)含量测定参照赛闹汪青等[13]的方法；可溶性糖含量测定采用苯酚法[14]；游离脯氨酸含量测定参照李合生[15]的方法；叶绿素(a+b)含量测定按照张伏等[16]的方法。各指标均以叶片鲜质量计。

1.3 数据分析

采用SPSS 20.0和Orign 8.50软件对试验数据进行分析处理并作图。

2 结果与分析

2.1 SNP对低温胁迫下伏毛铁棒锤种子萌发的影响

SNP对低温胁迫下伏毛铁棒锤种子萌发的影响见图1和图2。

标不同小写字母表示同一温度下不同处理间在P<0.05水平上有显著性差异；不同大写字母表示同一处理下不同温度间在P<0.05水平上有显著性差异。图2同Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at same temperature at P<0.05 level,and different uppercase letters indicate significant differences in same treatment at different temperatures at P<0.05 level.The same as Fig.2图1 SNP对低温胁迫下伏毛铁棒锤种子萌发率和萌发势的影响Fig.1 Effects of SNP on seed germination rate and germination potential of Aconitum flavum Hand.-Mazz under low temperature stress

由图1和图2可看出，经破除休眠的伏毛铁棒锤种子，其萌发率、萌发势及活力指数均对温度较为敏感。与15 ℃相比，8 和4 ℃低温下各处理组伏毛铁棒锤种子萌发率、萌发势及活力指数均显著下降(P<0.05)。在8和4 ℃条件下，随着SNP溶液浓度增大，伏毛铁棒锤种子的萌发率、萌发势及活力指数均呈现先升高后降低的趋势，且均在SNP溶液浓度为200 μmol/L时达到最高；与未添加SNP组相比，8 ℃下200 μmol/L SNP处理种子萌发率、萌发势及活力指数分别提高了16.0%，9.8%，14.0%；4 ℃下分别提高了10.4%，9.3%，11.0%。结果表明，200 μmol/L SNP溶液处理有效缓解了低温胁迫对伏毛铁棒锤种子萌发的影响。15 ℃下，当SNP溶液浓度小于200 μmol/L时，各处理种子的萌发率、萌发势及活力指数间差异均不显著(P>0.05)；8和4 ℃下随着SNP溶液浓度增大，各处理种子的萌发率、萌发势及活力指数相比对照均显著提高(P<0.05)。当SNP溶液浓度高于200 μmol/L时，15，8和4 ℃下种子萌发率、萌发势及活力指数均显著下降，这可能是高浓度NO分子作为自由基对种子萌发造成了一定的毒害。

图2 SNP对低温胁迫下伏毛铁棒锤种子萌发活力指数的影响Fig.2 Effects of SNP on seed germination vitality index of Aconitum flavum Hand.-Mazz under low temperature stress

2.2 SNP对低温胁迫下伏毛铁棒锤幼苗生理特性的影响

2.2.1 对SOD、POD、CAT活性的影响 SNP对4 ℃下伏毛铁棒锤幼苗SOD、POD、CAT活性的影响见图3和图4。

图柱上标不同小写字母表示同时间下不同处理间在P<0.05水平有显著性差异。下图同Different lowercase letters indicate significant difference between treatments at same time at the P<0.05 level. The same below图3 SNP对4 ℃下伏毛铁棒锤幼苗SOD、POD活性的影响Fig.3 Effects of SNP on SOD and POD activities of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃

由图3和图4可知，4 ℃低温胁迫下，随着胁迫时间的延长，伏毛铁棒锤幼苗体内SOD、POD、CAT活性持续上升；而同时段不同浓度SNP处理SOD、POD、CAT活性均随着SNP处理浓度的增加，呈先升高后降低的趋势，当SNP溶液浓度为200 μmol/L时，SOD、POD、CAT活性均达到最高，此时SOD活性在24，48，72 h时间段内分别较对照显著提高了354.61%，335.11%和309.72%，POD活性分别显著提高了77.78%，560.00%和583.33%，CAT活性分别显著提高了189.64%，265.44%和446.01%。结果表明，适宜浓度SNP溶液可提高低温胁迫下伏毛铁棒锤幼苗的抗氧化酶活性。

图4 SNP对4 ℃下伏毛铁棒锤幼苗CAT活性的影响Fig.4 Effects of SNP on CAT activities of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃

2.2.2 对MDA含量的影响 由图5可知，在4 ℃低温胁迫下，随着胁迫时间的延长，伏毛铁棒锤幼苗体内MDA含量均持续增加；而同时段不同SNP处理幼苗体内MDA含量随着SNP处理浓度的增加，呈先降低后升高的趋势。当SNP溶液浓度为200 μmol/L时，MDA含量显著降低，此时24，48，72 h时段分别较对照降低171.55%，131.17%，187.71%。当SNP溶液处理浓度高于200 μmol/L时，MDA含量又持续上升。可见SNP溶液处理浓度过高不利于伏毛铁棒锤幼苗的生长。

图5 SNP对4 ℃下伏毛铁棒锤幼苗MDA含量的影响 图6 SNP对4 ℃下伏毛铁棒锤幼苗H2O2含量的影响Fig.5 Effect of SNP on MDA content of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃ Fig.6 Effect of SNP on H2O2 content of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃

2.2.3 对H2O2含量的影响 由图6可见，4 ℃低温胁迫下，随着胁迫时间的延长，伏毛铁棒锤幼苗体内H2O2含量均持续增加；而同时段不同SNP处理幼苗体内H2O2含量随着SNP处理浓度的增加呈先降低后升高趋势。与对照相比，当SNP溶液浓度为200 μmol/L时，H2O2含量显著降低，24，48，72 h分别较对照降低114.45%，67.10%，70.21%；当SNP溶液处理浓度高于200 μmol/L时，H2O2含量又持续上升。表明适宜浓度SNP有效减少了伏毛铁棒锤幼苗体内H2O2含量，从而保护了幼苗免受H2O2等ROS的毒害作用。

2.2.4 对可溶性糖和游离脯氨酸含量的影响 SNP对4 ℃低温胁迫下伏毛铁棒锤幼苗体内可溶性糖和游离脯氨酸含量的影响如图7所示。

图7 SNP对4 ℃下伏毛铁棒锤幼苗渗透调节物质含量的影响Fig.7 Effect of SNP on content of osmotic adjustment substance of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃

由图7可知，4 ℃低温胁迫下，随着低温胁迫时间的延长，伏毛铁棒锤幼苗体内可溶性糖和游离脯氨酸含量总体呈持续增加；而同时段不同SNP处理幼苗体内可溶性糖和游离脯氨酸含量均随SNP处理浓度的增加呈先增大后减小的趋势。当SNP溶液浓度为200 μmol/L时，伏毛铁棒锤幼苗体内可溶性糖和游离脯氨酸含量均达最大值，24，48，72 h可溶性糖含量分别较对照增加了239.53%，205.45%，154.17%；游离脯氨酸含量分别较对照增加了170.16%，182.53%，229.57%。当SNP溶液处理浓度高于200 μmol/L时，伏毛铁棒锤幼苗体内可溶性糖和游离脯氨酸含量又持续下降。结果表明，200 μmol/L的SNP有效促进了可溶性糖和游离脯氨酸含量的积累，作为渗透调节物质稳定了细胞水势和膨压，避免伏毛铁棒锤幼苗体内生物大分子结构和功能遭到破坏，从而缓解了逆境胁迫对幼苗造成的伤害。

2.2.5 对叶绿素(a+b)含量的影响 SNP对4 ℃下伏毛铁棒锤幼苗叶绿素(a+b)含量的影响见图8。由图8可知，4 ℃低温胁迫下，随着胁迫时间的延长，伏毛铁棒锤幼苗体内叶绿素(a+b)含量持续下降；而同时段不同SNP处理伏毛铁棒锤幼苗体内叶绿素(a+b)含量随着SNP处理浓度的增加呈先升高后降低的趋势。当SNP溶液浓度为200 μmol/L时，不同低温胁迫时段伏毛铁棒锤幼苗体内叶绿素(a+b)含量均达到峰值，24，48，72 h分别较对照增加82.35%，92.31%，111.11%；当SNP溶液处理浓度高于200 μmol/L时，叶绿素(a+b)含量又逐渐下降。表明适宜浓度的SNP可缓解低温对伏毛铁棒锤幼苗叶绿素合成的影响。

图8 SNP对4 ℃下伏毛铁棒锤幼苗叶绿素(a+b)含量的影响Fig.8 Effects of SNP on chlorophyll (a+b) content of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃

3组不同处理伏毛铁棒锤幼苗叶绿素 (a+b)含量见表1。由表1可知，4 ℃胁迫未经缓解的幼苗叶绿素(a+b)含量较对照降低86.76%(P<0.05)；而4 ℃胁迫经200 μmol/L SNP缓解过的幼苗较对照降低77.20%，且较未经缓解组显著提高72.22%。从图9也可以看出，与15 ℃下对照组幼苗相比，4 ℃胁迫后用200 μmol/L SNP缓解过的伏毛铁棒锤幼苗叶片颜色泛黄，而4 ℃胁迫未经缓解组幼苗表现更甚。这种表型特征与叶绿素(a+b)含量变化趋势完全吻合，表明SNP有效促进了低温胁迫下光合色素含量的积累。

图9 SNP对4 ℃胁迫下伏毛铁棒锤幼苗表型特征的影响Fig.9 Effects of SNP on phenotype characteristics of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃

表1 不同处理对伏毛铁棒锤幼苗叶绿素(a+b)含量的影响Table 1 Effects of different treatments on chlorophyll (a+b) content of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings

3 讨 论

低温是植物的环境胁迫因子之一，影响植物的正常生长发育，降低产量，影响品质，给种植户造成严重的经济损失。本研究结果显示，与对照15 ℃相比，8和4 ℃低温处理下伏毛铁棒锤种子的萌发率，萌发势及活力指数均显著降低；但施加SNP溶液后，伏毛铁棒锤种子的萌发率、萌发势及活力指数均呈先升高后降低的趋势，且均在200 μmol/L SNP下达到最大值。表明适宜浓度的外源NO可有效提高伏毛铁棒锤种子的低温耐受性。

叶绿素是植物进行光合作用的必要色素，低温可导致叶绿体变形，使叶绿素和类胡萝卜素含量下降，同时低温使光合酶活性和光合电子传递速率受到抑制[24]。于秀针等[25]研究发现，100～1 000 μmol/L SNP溶液均能提高番茄幼苗叶片的叶绿素及脯氨酸含量。杜晓等[26]研究指出，可溶性糖不仅是植物体进行新陈代谢所需能量的主要原料物质，而且对植物体应对逆境胁迫起到渗透调节作用。本研究结果显示，SNP溶液浓度为200 μmol/L时，伏毛铁棒锤幼苗叶绿素(a+b)、可溶性糖及游离脯氨酸含量显著提高。叶绿素(a+b)含量提高使得伏毛铁棒锤幼苗能正常进行光合作用，可溶性糖和游离脯氨酸含量增加能够稳定细胞水势和膨压，进而降低细胞冰点，避免伏毛铁棒锤幼苗体内生物大分子结构和功能遭受破坏。

4 结 论

施加适宜浓度的外源NO(SNP溶液)可提高伏毛铁棒锤种子对低温的耐受性；SNP溶液最佳浓度为200 μmol/L；伏毛铁棒锤幼苗可通过调节抗氧化酶活性来清除由低温胁迫积累的过剩活性氧等有害物质；通过增加渗透调节物质含量降低细胞冰点，进而减少细胞结冰，避免体内生物大分子结构和功能遭受破坏。