碱水解-SPE-HPLC-MS/MS法检测乳制品中喹乙醇及代谢物

林琳

（江苏康正生物科技有限公司，江苏高邮225600）

0 引 言

喹乙醇(O laquindox)又称喹酰胺醇，属喹噁啉类化合物，对人体有致突变和致癌的作用[1-3]。中国自2019年5月1日起停止使用喹乙醇兽药的原料药及各种制剂[4-5]。而3-甲基-喹喔啉-2-羧酸（3-m ethyl-quinoxaline-2-carboxy,MQCA）作为喹乙醇的主要代谢产物之一[6]，在体内残留量相对稳定。

目前对喹乙醇及其代谢物常用的检测方法有高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法[7-12]。高效液相色谱法前处理复杂，容易产生假阳性；而高效液相色谱-质谱联用法可以在降低检出限的同时避免假阳性的产生。喹乙醇及代谢物的前处理一般有酶解法和酸解法[13-17]，但是两者的效果都不太理想。本试验拟建立碱水解提取，固相萃取法净化和液相串联质谱联用的检测方法，为快速检测和监管乳制品中喹乙醇及其代谢物残留提供技术保障和参考。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

Agilent1120型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；API 3500 Q T rap超高压液相色谱-三重四级杆串联质谱仪，美国AB公司。

喹乙醇和MQCA标准物质购于中国计量科学研究院。

1.2 样品来源

样品均为随机的市售乳制品。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱型号：Waters ACQU ITY UPLC BEH C18柱色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7μm)；色谱柱温度为35℃；进样量为5μL；流速为0.30 m L/min;流动相A为0.1%氨水溶液，B为乙腈；洗脱条件如表1所示。

表1 HPLC-MS/MS梯度洗脱条件

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源为正离子电离(ESI+)；监测模式为多反应监测(MRM)；离子源温度为105℃；毛细管电压为3.0 kV；脱溶剂气流量为10 L/min；锥孔流量为0.5 L/min；去溶剂温度为400℃。

1.3.3 样品的提取与净化

称取5 g(精确至0.01 g)乳制品样品至50 m L离心管中，加入25 m L浓度为2 m oL/L的N aOH溶液，混合均匀，50℃水浴条件下水解60min。然后再加入HC l溶液将水解液调至pH值7.0后,转速为5 000 r/min离心5 min。取上清液加入固相萃取柱，分别用6 m L甲醇和水依次活化后上样，首先弃去流出液，然后用6 m L水洗涤，弃去流出液，用3 m L质量分数为1%的氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液并于40℃氮气吹干。残余样品用1.0 m L流动相溶解混匀，用0.22μm有机滤膜过滤，供液相串联质谱检测。

1.3.4 标准曲线的建立

分别称量10 m g喹乙醇和MQCA标准品用甲醇配制成1 m g/m L的标准储备液，再稀释成质量浓度均为1μg/m L中间标准溶液。临用前，将质量分数为0.1%甲酸水溶液配制成质量浓度为0.1～50 ng/m L的系列标准曲线。

1.3.5 方法的精密度、重复性与回收率

以未检出喹乙醇和MQCA的乳制品为空白基质，加入3个梯度的混合标液，碱水解提取后使用固相萃取柱净化和富集后，上机检测计算回收率。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

由于喹乙醇和MQCA为极性一般的弱酸性化合物[18]，实验考察了Waters ACQU ITY UPLC BEH C18柱色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7μm)和Waters A talantis T3（2.1×50 mm，3μm）这2款不同的色谱柱对其分离效果的影响。结果发现，两种目标物在C18柱上有好的保留效果好，喹乙醇和MQCA的峰形得到改善，与基质中的杂质也有较好的分离度，峰型尖锐，整个分离过程可以在5 min内完成。

2.2 流动相体系的选择

流动相的组成会影响目标化合物的分离和离子化效率，从而影响到目标化合物的灵敏度。在流动相选择中，比较了纯甲醇、纯乙腈、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.10%甲酸、甲醇-0.1%氨水、乙腈-0.1%氨水作为流动相条件下喹乙醇和MQCA检测灵敏度及出峰情况。结果发现，流动相体系中含有乙腈会改善起到目标物峰形的作用，乙腈-0.10%甲酸及乙腈-0.1%氨水均能分离测定喹乙醇和MQCA。但乙腈-0.10%甲酸流动相体系下，喹乙醇响应低且MQCA峰形拖尾展宽严重；乙腈-0.1%氨水体系下，两个目标物均有较高响应，峰形窄，且分离时间缩短，在3 min内就能完成分离，如图1所示，所以本试验选择流动相体系为乙腈-0.1%氨水（梯度洗脱）。

图1 两种流动相下的TIC图

2.3 质谱条件的选择

用质量浓度为50 ng/m L的混合标准溶液，对目标物进行一级和二级质谱扫描，并优化质谱参数。两种目标物的质谱分析参数如表2所示，包括目标物的母离子精确质量数，碎片离子的精确质量数以及去簇电压和碰撞电压参数。

表2 各化合物质谱参数

2.4 方法的线性范围与灵敏度

在乙腈-0.20%甲酸流动相体系中，以表1梯度洗脱的步骤，按1.3.4实验步骤配制MQCA的标准溶液，绘制标准曲线。结果表明：喹乙醇和MQCA在质量浓度为0.1～50.0 ng/m L内均具有良好的线性关系，结果如表3所示。

表3 2种目标物的出峰时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限

2.5 前处理方式的优

2.5.1 样品水解方式的选择

水解方式一般为酶水解、酸水解、碱水解3种[19-20]，酶水解过程十分温和，需在50℃振荡水浴中反应24 h，酶解过程耗时长且步骤繁琐；酸水解反应相对较温和，所以对于乳制品等样品，其水解效率不高。因为喹乙醇和MQCA与样品基质主要是共价结合，采用酶解和酸解的方式并不能完全将喹乙醇和MQCA从样品基质中解离出来。强碱水解相对于酶解和酸解效果更好，反应通常较为剧烈，能在短时间内有效水解样品中的蛋白质并将喹乙醇和MQCA从基质中解离出来。试验通过改变碱水解时间以及N aOH碱溶液的浓度，通过水解液状况评价水解效果。选择水解时间分别为20，40，60，80，100，120min，N aOH溶液浓度分别采用 0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 m oL/L，在60℃条件下对样品进行水解。通过对比发现，N aOH浓度太低，水解过程耗时长；N aOH浓度越高水解液相反会变得浓稠，不适合后续的提取净化过程。选用2.0 m oL/L N aOH溶液水解60 min时，基质样品被完全水解，MQCA从样品中被完全释放出来，没有残渣剩余。因此，选择该条件进行后续试验。

2.5.2 SPE柱的选择

由于喹乙醇及MQCA的化学结构中具有喹喔啉-1,4-二氮氧结构，其在弱碱或者酸性条件下能离子化成为分子，实验对比了已经商品化了的H LB、PAX以及MAX 3款固相萃取小柱的做净化效果对比，记录下目标物峰面积，分析不同类型的SPE柱对喹乙醇及MQCA提取的影响，结果如图2所示。

图2 喹乙醇及MQCA经不同SPE柱处理后的回收率

由图2可知，MAX小柱回收率最好，两个目标组分的回收率最高，且不同类型SPE柱间目标组分的回收率差异显著(P＜0.05），因此选择MAX小柱进行固相萃取净化。且对60 m g/3 m L和150 m g/6 m L两种规格的MAX小柱进行比较，发现对喹乙醇及MQCA都有非常好的保留，回收率没有明显差异，从节省成本的角度考虑，60m g/3 m L小柱更为合适。

2.6 方法的精密度、重复性与回收率

在加标回收实验中，分别选用灭菌乳和乳粉基质2种动物源性基质的样品，分别添加2倍限量、5倍限量和10倍限量低、中、高的3个水平混合标准品，每个结果测定5次，进行加标回收的试验。

表4 方法的回收率及相对标准偏差(n=5)

由表4可见，在两种不同的种类基质样品中，喹乙醇及MQCA的回收率为81.6%～97.1%，精密度为2.15%～5.67%，说明本实验的检测数据的准确度和精密度可行。

3 结 论

本文通过在碱性环境下水解提取样品中的喹乙醇及MQCA，经60 m g/3 m L的MAX固相萃取小柱净化处理后，建立了一种快速、准确检测喹乙醇及其代谢物MQCA在乳制品中残留量的SPE-HPLC-MS/MS方法。在灭菌乳基质和乳粉基质样品基质中的加标回收率为81.6%～97.1%，对标准偏差为2.15%～5.67%(n=5)。该方法具有可靠的准确度和精密度，能准确快速有效地检测乳制品中的喹乙醇及MQCA的残留量，可为该方面的分析和监控提供技术支持。