PacBio测序分析开菲尔发酵过程中细菌演替

史大伟，邢军，马龙，李安，于红，古丽加马力·艾萨，张瑞

（1.新疆师范大学生命科学学院乌鲁木齐830054；2.新疆大学生命科学与技术学院乌鲁木齐830046）

0 引 言

开菲尔是一种传统的发酵乳饮料，可缓解乳糖不耐受症、胃肠道疾病和高血压等[1-5]。富含的微生物能发酵产生有机酸、抗生素和多种香气，其中细菌数量占比较大，起到较重要的作用，对开菲尔的发酵有较大影响[6-13]。

单分子实时测序技术（Single Mo lecu le R eal-Tim e sequencing，SMR T）是目前正在使用的新的测序技术之一，该新技术不仅能获得更长、更准确的DNA序列，而且与传统的方法一样可靠和准确，能快速、准确地在物种水平上识别微生物[14-15]。为了解开菲尔在发酵前后细菌群落的结构和种群变化动态，本研究在0～96 h发酵时间段采集了15份牧民手工制作的发酵样品中的细菌，为分离鉴定开菲尔功能细菌的研究奠定基础，同时，为开菲尔发酵过程中细菌菌落的结构和种群动态变化提供数据。

1 实 验

1.1 材料

样品取自新疆喀什地区的牧民家中，置于冰盒冷藏待用。发酵牛乳乌鲁木齐市超市购买。

1.2 方法

1.2.1 鲜乳杀菌处理

乌鲁木齐市超市购买西域春牌牛奶作为开菲尔发酵基质，采用85℃热处理20 min，备用。

1.2.2 开菲尔粒制备与活化

本实验室于2018年制备获得的开菲尔粒固态发酵剂（原料采自喀什山区牧民家庭制作奶疙瘩，后经过冰盒冷冻保存至实验室）→粉碎→过40目筛→温水30℃泡洗3次→按质量比1∶5加入30℃水打浆→均质→按1∶10比例接种在25℃已消毒牛乳中→25℃培养12 h→过滤获得开菲尔粒→-4℃冷藏备用。

1.2.3 接种开菲尔粒进行发酵培养

活化后获得的开菲尔粒，分别接种于3个装有灭菌鲜乳培养基的三角瓶中，37℃恒温培养箱密封培养，分别在0、24、48、72、96、120 h从3个发酵瓶中取样三份。标记后-80℃冰箱冷冻保存待测。

1.2.4 pH值和滴定酸度的测定

使用精密pH计测量样品的pH值，每样品3个平行。准确称取5 g开菲尔，加40 m L的蒸馏水，3滴酚酞指示剂，混匀，用标准0.1m o l/L N aOH溶液滴定[16]。

1.2.5 样品总DNA提取

通过PCRBIO Taq DNA聚合酶提取样品总DNA。

引物为：27F（5’-gagagtttgatcctggctcag-3’）

引物包含一组16个核苷酸的条形码。最终反应混合物的体积为50μL。每个样品包含1×PCRBIO反应缓冲液，10 m g模板DN A，每个引物10 m o l和1μg Taq DNA聚合酶。反应条件如下：95℃5 min，然后在95℃30 s，58℃ 45 s和52℃ 1 min进行30个循环，最终延伸52℃5 min。使用Agilent DNA 1000试剂盒和Agilent 2100生物分析仪检查PCR产品的质量。纯化的PCR产物用于通过模板制备试剂盒2.0（Pacific Biosciences Tem p late Prep K it 2.0）构建DNA文库。

1.2.6 样品PacBio SMRT上机测序

建库测序：提取样品总DN A后，根据16S全长引物27F和1541R，合成带有Barcode的特异引物，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库（SMRT Bell），建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用PacBio Sequel进行测序。PacBio Sequel下机数据为bam格式,通过sm rtlink分析软件导出CCS文件,根据Barcode序列识别不同样品的数据并转化为fastq格式数据。

1.2.7 序列处理与生物信息学分析

原始数据是根据RS R eadsO finsert.1生成的。Q IIME软件包用于获取高质量序列。为了提取高质量序列，将最小全通量，最小预测准确性，最小插入片段读取长度和最大读取长度分别设置为5、90、1 400和1 800 bp。去除条形码和引物序列以创建数据集。以选择读取长度超过425 bp的序列。然后，将PyNAST和UCLUST用于在序列同一性为100%聚类下比对序列，以获得代表性序列。之后通过UCLUST将序列分类为可操作的分类单位（OTU），其阈值为95%。核糖体数据库用于每个O TU代表序列的分类分配80%的置信度阈值。使用FastT ree中设置的代表性OTU进行分类用于下游分析。α多样性由Shannon-Wiener，Sim pson指数，Chao1指数和稀释性曲线计量评估。加权和非加权计算都应用于主成分分析（principal co-ordinates analysis）以分析微生物群落。使用R软件包3.1.2版和O rigin软件8.5版生成图形。

2 结果与讨论

2.1 开菲尔细菌多样性分析

2.1.1 测序深度评估

为了更全面地揭示开菲尔微生物群落组成及多样性信息，采用了Pac Bio测序技术对不同发酵时间开菲尔样品的微生物群落进行了解析（如图1）。

图1 开菲尔发酵样品稀疏曲线和香农曲线

由图1可知，对于细菌群落，共获得高质量序列61 682条，平均每个样本含有4 072条；根据97%的序列相似度对序列进行OTU划分，共获得1 062个OTU，总体而言，每个开菲尔样品的覆盖率(coverage)均在99%以上，表明测序的深度可以准确反映开菲尔发酵过程细菌群落的真实情况。各发酵样品的稀疏曲线均未进入平台期，因此随着测序量的增加有可能发现新的细菌，另一张图显示随着测序深度的增加香农曲线已进入平台期，说明在该测序深度下，发酵样品中的细菌的多样性可以被充分展示。因此本研究中细菌测序量满足后续生物信息学分析的要求。

2.1.2 开菲尔细菌多样性

细菌群落的Chao1指数在发酵0～96 h呈现先下降后上升再下降后上升的态势，且在0 h达到最大值54.68±0.95。辛普森指数呈现先上升后下降再上升后下降的态势，且在0 h达到最值0.09±0.03。说明开菲尔发酵过程中细菌群落组成前期大于发酵后期，后期发酵细菌多样性较小，见表1。

2.1.3 开菲尔细菌菌群构成

在采样的开菲尔中鉴定出2个细菌门，主要门为厚壁菌门（Firmicutes）变形菌门（Proteobacteria）。在发酵过程中厚壁菌门呈现逐渐增加的趋势。以下为0～96 h相对丰度数据（4.37%、62.80%、59.01%、74.58%、85.69%），在发酵0～96 h之间96 h达到最值。变形菌门呈现逐渐下降的趋势，为0～96 h相对丰度数据（91.74%、37.20%、40.96%、25.42%、4.30%），在发酵0 h处于相对最大值。

表1 开菲尔发酵样品多样性指数表

开菲尔发酵样品中鉴定了30个属，相对丰度大于1%属（图2），在发酵0 h相对丰度大于1%的菌属为：肠杆菌属（Enterobacter）8%，蛭弧菌属（Bdellovibrio）15%，嗜甲基菌属（Methylophilus）14%，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）12%，罗尔斯顿菌属（Ralstonia）9%，弯曲杆菌属（Curvibacter）7%，食酸菌属（Acidovora x）7%，苯细菌属（Phenylobacterium）5%。在发酵24 h仅有两种菌属芽孢杆菌属（Bacillus）61%和肠杆菌属（Enterobacter）37%。在发酵48 h有4种菌属气单胞菌属（Aeromonas）40%，嗜热杆菌属（Exiguobacterium）42%，链球菌属（Streptococcus）14%。72 h有4种菌属芽孢杆菌属（Bacillus）73%，肠杆菌属（Enterobacter）7%，气单胞菌属（Aeromonas）18%。96 h有3种芽孢杆菌属（Bacillus）64%，肠杆菌属（Enterobacter）8%，链球菌属（Streptococcus）22%。

图2 发酵样品细菌属组成的柱状

图2中，KSX 001-003为喀什开菲尔发酵0 h样品；KSX 241-243为喀什开菲尔发酵24 h样品；KSX 481-483为喀什开菲尔发酵48 h样品；KSX 721-723为喀什开菲尔发酵72 h样品；KSX 961-963为喀什开菲尔发酵96 h样品。

在发酵过程中芽孢杆菌属呈现先逐渐增加的趋势，在72 h相对丰度达到最大值73%（0～96 h发酵过程中的变化趋势为3%，61%，0%，73%，64%）、肠杆菌属呈现先增加后减少再增加的趋势，在24 h达到最大值（0～96 h发酵过程中的变化趋势为8%，37%，1%，7%，8%）气单胞菌呈现先增后减的趋势，在48 h达到最大值（0～96 h发酵过程中的变化趋势为1%，0%，40%，18%，0%）、链球菌属呈现先增加后减少再增加的趋势，在96 h达到最大值（0～96 h发酵过程中的变化趋势为0%，1%，14%，2%，22%）。

图3中，0 h为喀什开菲尔发酵0 h样品；24 h为喀什开菲尔发酵24 h样品；48 h为喀什开菲尔发酵48 h样品；72 h为喀什开菲尔发酵72 h样品；96 h为喀什开菲尔发酵96 h样品。由图3可知，在0 h鉴定到6种菌种：炭疽芽孢杆菌（Bacillus.anthracis）2%、肠杆菌（Enterobacter sp）8%、嗜水气单胞菌（Aeromonas.diversa）1%、嗜甲基菌（Methylophilus.sp）14%、鞘氨醇单胞（Sphingomonas.leidyi）12%、细菌（bacterium）9%。在发酵24 h鉴定了3种：炭疽芽孢杆菌（Bacillus.anthracis）61%、肠杆菌（Enterobacter.sp）37%、唾液链球菌（S.oralis.subsp）1%。在发酵48 h鉴定到了4种：肠杆菌（Enterobacter.sp）1%、嗜水气单胞菌（Aeromonas.diversa）40%、微小杆菌（Exiguobacterium.sp）42%、唾液链球菌（S.oralis.subsp）14%。在发酵72 h鉴定到了4种：炭疽芽孢杆菌（Bacillus.anthracis）73%、肠杆菌（Enterobacter.sp）7%、嗜水气单胞菌（Aeromonas.diversa）18%、嗜热链球菌（S.thermophilus）2%。在发酵96 h鉴定到4种炭疽芽孢杆菌（Bacillus.anthracis）64%、肠杆菌（Enterobacter.sp）8%、唾液链球菌（S.oralis.subsp）7%、嗜热链球菌（S.thermophilus）15%。炭疽芽孢杆菌在发酵过程中0～24h呈现增加的趋势，在发酵48 h相对丰度为0，随着发酵的进行逐渐增加，相对丰度在发酵72 h达到最大值。肠杆菌在发酵过程中呈现先增后减的趋势，在0～24 h逐渐增加，肠杆菌在48 h相对丰度也为0，在72～96 h逐渐增加。唾液链球菌呈现先增后减的趋势，在48 h相对丰度达到最大值。嗜热链球菌在发酵过程中呈现增加趋势，在0～48 h为检测到嗜热链球菌，在72～96 h嗜热链球菌逐渐增加，96 h达到最大值。

图3 开菲尔发酵样品0～96 h细菌种组成的柱状

2.2 开菲尔细菌差异性

2.2.1 开菲尔细菌差异性分析

图4为不同发酵时间开菲尔样品细菌群落的PCoA分析，结果显示了开菲尔样品在发酵过程中细菌群落的相似性及差异性。

开菲尔发酵样品分布于3个象限，其中发酵0 h（刚开始发酵的开菲尔）的样品单独位于第2象限，表明0 h样品中细菌群落与24～96 h样品细菌群落差异较大。发酵24、48 h的样品位于第4象限。发酵72、96 h的开菲尔样品同时分布于第4象限。不同发酵时间样品之间存在差异性，分布结果同多样性指数相符合。由此可以分为4个阶段：(1)发酵0 h，细菌多样性最高，(2)发酵24 h，细菌多样性开始下降，细菌结构迅速调整；(3)发酵48 h细菌多样性增加。(4)发酵72～96 h，细菌多样性变化较小，群落结构趋于稳定。使用PCoA分析了细菌群落差异性，结果显示不同发酵时间开菲尔样品之间细菌群落组成有明显差异。

图4 发酵样品PCoA图

2.2.2 开菲尔细菌与环境因子相关性

在开菲尔发酵过程中，物种与环境因子相关性可为两类，一类是pH有关，与发酵过程中大多数物种呈正相关关系；另外一类Lactic(滴定酸度)，与发酵过程中大多数物种呈负相关关系，如图5。

图5 发酵样品细菌与环境因子关系

由图5可知，其中嗜热杆菌属（Exiguobacterium）、棒杆菌属（Caulobacter）、气单胞菌属（Aeromonas）、葡萄球菌属（Streptococcus）、杆菌属（Thermomonas）与pH呈正相关；芽孢杆菌属（Bacillus）、链球菌属（Streptococcus）、肠杆菌属(Enterobacter)与pH呈负相关。气单胞菌属(Aeromonas)、细菌灭弧菌属(Bacteriovorax)与滴定酸度（Lactic）呈正相关，鞘氨醇属（Sphingobium）、罗尔斯顿菌属(Ralstonia)、弯曲杆菌属(Curvibacter)、嗜甲基菌属(Methylophilus)与滴定酸度（Lactic）呈负相关。

3 结果与讨论

开菲尔发酵过程中细菌群落对于开菲尔制品的质量具有重要意义。目前许多生物学方法已被用来表征开菲尔发酵过程中的细菌群落[17-18]。在本研究中，采用PacBio SMRT测序共检测到2个门、30个属、8个种的细菌，其中优势菌门为厚壁菌门和变形菌门。其中优势菌属为：芽孢杆菌属、肠杆菌属、气单胞菌、链球菌属。鉴定的种为：炭疽芽孢杆菌（Bacillus.anthracis）、嗜甲基菌（Methylophilus.sp）、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas.leidyi）肠杆菌（Enterobacter.sp）、嗜水气单胞菌（Aeromonas.diversa）、微小杆菌（Exiguobacterium.sp）唾液链球菌（S.oralis.subsp）、嗜热链球菌（S.thermophilus）。与其他的测序分析开菲尔相比揭示了新的种[19]。

Gesudu等[20]通过单分子实时测序技术分析库米斯（一种发酵乳制品）细菌群落中演替的动态过程表明，瑞士乳杆菌从0到9 h丰度增加，在9 h达到高峰，然后下降。相比之下，粪肠球菌，杜兰肠球菌和卡塞尔肠球菌在整个发酵过程中逐渐增加，并在24 h后达到最大值。刘文俊等[21]通过PacBio三代测序技术对传统酸马奶进行研究,鉴定到种为：瑞士乳杆菌、乳酸乳球菌、副乳链球菌、棉子糖乳球菌、肠膜阴串珠球菌和产马乳酒乳杆菌等，与本研究有差异。开菲尔在发酵前期存在大量的细菌，随着发酵的进行细菌种类逐渐减少并趋于稳定。Bourrie BC等[22]研究发酵开菲尔中的微生物发现：主要由厚壁菌门和变形菌门组成，属水平则主要由乳酸菌属和醋酸杆菌属组成，其次是芽孢杆菌属和链球菌属，种水平除了比较常见的嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、乳酪链球菌、双歧杆菌、醋酸酐菌、酿酒酵母菌、白色念珠菌、干酪乳杆菌和卷曲乳杆菌外，还有特异的开菲尔乳杆菌、马乳酒样乳杆菌、开菲尔念珠菌等。贾宇声等[23]鉴定出的主要细菌是副氏乳杆菌，其次是醋酸杆菌，开菲乳杆菌和乳酸乳球菌，与本研究有差异。有研究报道，发酵剂培养类型、贮藏期和哺乳动物物种以及温度和pH的变化对发酵乳中微生物都有显著影响[24-25]。