核黄素超声结晶工艺优化

陈亮，田飞豹，辛秀兰，兰蓉，于然，吴志明，梁浩，3

（1 北京电子科技职业学院生物工程学院，北京100176；2 北京化工大学化工资源有效利用国家重点实验室，北京100029；3 北京化工大学秦皇岛环渤海生物产业研究院，河北秦皇岛066000）

核黄素，别名维生素B2，是维生素B族的重要组成部分，其前身为维生素G，分子式为C17H20N4O6，分子量376.37，CAS 号为83-88-5，根据化学结构对其命名为7,8-二甲基-10(1’-D-核糖醇基)-异咯嗪[1]，结构式见图1。

图1 核黄素结构式

核黄素是生物体内黄素的主要来源，其衍生物黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）是大多数黄素辅酶不可或缺的活性基团。这些黄素辅酶在体内氧化还原稳态、蛋白折叠、DNA 修复、脂肪酸β-氧化、氨基酸氧化和胆碱代谢等生理功能方面发挥着重要的作用[2-7]。研究发现，核黄素可以改善不同疾病常规治疗的效率[8-10]、发挥保护组织免受氧化损伤[11-13]等辅助功效。美国食品营养委员会推荐成人每日摄取核黄素的剂量是0.9～1.3mg。其不仅被广泛应用于临床中，而且由于其无毒害并颜色呈黄色，也经常作为营养添加剂和色素应用在食品工业中[14]。核黄素是进入国际市场上较早的几个维生素之一，国内外临床应用、保健、抗衰老类制剂超过二百多种，由于食品工业、保健品及营养添加剂工业的快速发展，市场对核黄素的需求也将不断上升。

核黄素的晶习一般分为三种，即针状、粉末状和块状。目前大多数是针状的结晶体，但是其堆密度小，流动性能差，加工性能差，处理难度大，最终会影响压片等加工性能。Saprykin 等[15]研究表明可以通过使用胶黏剂来提高核黄素的加工性能，然后使用硫化床进行喷雾干燥从而提高流动性能，但是这种方法过程繁杂，成本也会增高。溶液结晶经常被用于有机可溶性物质以及无机盐的分离纯化，溶液结晶不仅可以把溶质转变成固体从溶液中分离，而且还被广泛应用于晶体物质的纯化。当超声波被施加到溶液中的介质时，不仅可以使介质的运动速度加快，而且还能产生声空化作用。液体溶液在超声波的作用下会形成局部的负压区，在负压区中介质分子比较稀疏、离散，密度减少从而形成空化气泡，经过超声波的正负交变，也会产生正压区，在正压区会使介质密度增大。当超声波作用足够强大时，就会使气泡被压缩，从而使气泡体积减小，当超过气泡的承受能力后，空化气泡就变得不稳定，从而溃陷并逐步消失。超声结晶方法被认为是作为实现更快及均匀形成初级成核，并能在较低的过饱和水平下相对容易成核，来减少晶体结块的一个有效途径，能够显著地改善产品的工艺和物理特性[16]。因此，本文对核黄素超声辅助结晶进行研究，包括结晶方法的筛选、超声辅助条件的优化并进行产品表征。

1 材料及方法

1.1 材料与仪器

核黄素标准品（纯度＞98%）和核黄素粗品（饲料级，80%），赤峰制药厂；盐酸、乙酸钠、冰乙酸、无水乙醇、氢氧化钠，均为分析纯，北京试剂厂；去离子水，实验室自制。

紫外分光光度计，UV-2450，日本岛津公司；电子天平，Sartorius-BT25s，赛多利斯科学仪器有限公司；超声波细胞破碎仪，Biosafer 3D，宁波生物科技有限公司；光学显微镜，BME，LEICA；电子显微镜，H-800，日本日立公司。

1.2 核黄素含量测定

1.2.1 核黄素的光谱扫描[17]

称取核黄素标准品15.0mg，加入5mL 0.25%冰乙酸溶液，加热搅拌使核黄素充分溶解。随后转入100mL 容量瓶定容。取10mL 上述溶液，再用5mL 0.25%冰乙酸溶液定容至100mL，用蒸馏水作为空白，用紫外分光光度计进行光谱扫描，选择444nm作为测量核黄素的波长。

1.2.2 核黄素标准曲线的绘制

取10mg 核黄素，加入0.25%冰乙酸溶液，加热溶解后用去离子水定容到100mL。取上述标准液0、2.5mL、5mL、7.5mL、10mL、12.5mL、15mL，分别用0.25% 冰乙酸溶液定容到50mL，并在444nm处测定其吸光度值，记录数据，绘制标准曲线，根据吸光度值Y 与浓度x 建立回归方程Y=28.354x+0.0138，相关系数R2=0.9992，其在0.005～0.03mg/mL浓度范围内线性良好。

1.2.3 核黄素纯度测定

准确称量核黄素样品少许，加入0.25%冰乙酸溶液稀释，在444nm处测定吸光度值，根据核黄素标准曲线计算出核黄素纯度（%）。

1.3 结晶方法的筛选[18-20]

1.3.1 溶剂析出法

称取2.0g 核黄素粗品，加入10mL 36%（质量分数）浓盐酸溶解，在50℃条件下以300r/min的转速加热搅拌30min，然后加入200mL 90℃水，95℃继续加热2h，自然冷却至室温，抽滤，记录滤液体积并测量滤液中的核黄素浓度，固体物质烘干得到样品。

1.3.2 溶剂析出结合酸溶法

称取2.0g 核黄素粗品，加入16mL 23.8%（质量分数）盐酸溶液溶解，在30℃条件下以300r/min的转速搅拌30min，加入40mL 水，抽滤，记录滤液体积并测量滤液中的核黄素浓度，固体物质烘干得到样品。

1.3.3 控制结晶法

称取核黄素粗品2.0g，用120mL 水溶解，在80℃条件下加热回流30min，然后升温至100℃加热回流1h，降温至30℃，抽滤，用40mL 40℃水冲洗，再用40mL 甲醇冲洗，记录滤液体积并测量滤液中核黄素的浓度，固体物质烘干得到样品。

1.3.4 酸溶法

称取核黄素粗品2.0g，加入60mL 0.3%（质量分数）盐酸溶液，在80℃条件下加热回流30min，迅速冷却至室温，抽滤，记录滤液体积并测量滤液中的核黄素浓度，固体物质烘干得到样品。

1.3.5 碱溶法

称取核黄素粗品2.0g，加入40mL pH 为12 的氢氧化钠溶液进行溶解，过滤，滤液边搅拌边加入0.2%～0.25%（质量分数）双氧水20mL，搅拌1h，然后加酸调节pH 至4，抽滤，记录滤液体积并测量滤液中的核黄素浓度，固体物质烘干得到样品。

经上述方法处理后，样品称重，测定收率（%）和纯度（%），计算出综合效益（%）。综合效益（%）=收率×纯度×100%。

1.4 结晶影响因素的探讨

采用对比5种不同结晶纯化方法，根据综合效益筛选出最好的方法是酸溶法，在此基础上加入超声波作用，进一步探讨超声时间、功率和温度对核黄素的纯度、收率以及结晶度和晶习等方面的影响。

分别称取核黄素粗品2.0g，加入60mL 0.3%（质量分数）盐酸溶液，80℃条件下加热回流30min，迅速冷却至室温，接着分别在不同时间（15min、 25min、 40min）、 不 同 功 率（200W、400W、500W）以及不同温度（30℃、40℃、50℃）这3 个参数变量条件下进行超声处理，冷却至30℃，抽滤，水洗，甲醇洗，记录滤液体积并测量核黄素浓度，固体物质烘干得到样品，计算收率、纯度和综合效益。

1.5 核黄素超声结晶后的表征分析

分别采用光学显微镜、投射电子显微镜及X射线衍射（XRD）对超声辅助结晶纯化的核黄素以及未进行超声辅助的核黄素进行结构分析。

1.5.1 光学显微镜及电子显微镜观察结构

分别取超声辅助结晶及未超声辅助结晶的核黄素样品各10mg溶于1mL盐酸-乙醇溶液中，混合均匀，各取1滴于载玻片及300 目铜网上，在载玻片上覆盖洁净的盖玻片，编号标记，使用光学显微镜及电镜观察结构。

1.5.2 XRD分析晶型

分别取超声辅助结晶及未超声辅助结晶的核黄素样品于80℃下干燥2h，研成粉末，各取少许于XRD 载物台上进行检测，计算结晶度（%）。结晶度（%）=非晶峰的积分强度/（非晶峰的积分强度+结晶部分的积分强度）×100%。

2 结果与讨论

2.1 结晶方法的筛选

表1 列出了5 种核黄素结晶方法纯化后的结果，溶剂析出法是基于被分离组分与溶剂分子间相互作用力的差异，本实验中以盐酸作为溶剂，以水作为析出剂，结晶时间长，影响因素较多不易控制；溶剂析出结合酸溶法综合效益相对溶剂析出法好；控制结晶法是以水作为溶剂，操作复杂，用时较长；酸溶法以盐酸为溶剂，溶解核黄素，最后结晶，操作简便，用时较短；碱溶法利用核黄素在碱性条件下溶解度大，但核黄素在碱溶液中易分解，同时需要经双氧水氧化，操作复杂且用时较长。因此，在5种结晶纯化方法中，酸溶法耗时短、操作简便、综合效益最高，故后续实验采用酸溶法进行研究。

2.2 结晶影响因素的探讨

传统的结晶方法中由于晶体生长过程的复杂性，在晶体成形的过程中伴随着溶液过饱和、成核、晶体生长和集聚，因此产品工业中试放大面临着极大的挑战。但是当超声引入溶液结晶，可以极大地改进结晶过程，改善核黄素晶体形状，使粒度分布均匀[16,21-23]，故实验通过在核黄素酸溶法结晶的基础上添加超声波，探索其对于结晶效果的影响。

表1 5种核黄素结晶方法的收率和纯度

2.2.1 超声时间对超声结晶纯度与收率的影响

在结晶纯化方法中加入超声辅助作用，在不用超声时间条件下，所得到的实验结果如图2所示。

图2 超声作用时间对结晶纯度和收率的影响

由图2所知，功率一定时，其纯度随着超声时间的延长有所增长，但增幅不大，综合效益随超声时间的增加而增加，故选择超声时间为40min。核黄素成核结晶需要一个诱导成核达平衡的过程，40min 结晶达到平衡稳定，故结晶的综合效益最高。同时，超声波可以降低溶液的过饱和浓度，晶体的成核生长速率也会随着溶液过饱和浓度的降低随之增加。因此，超声作用也加速了溶质分子从溶液到晶体表面的传递速率，缩短诱导期，提升了结晶的速度[24]。

2.2.2 超声功率对超声结晶纯度与收率的影响

在结晶纯化方法中加入超声辅助作用，在不用超声功率下，得到的实验结果如图3所示。

由图3 所知，随着超声功率的增大，其纯度有先增大后减小的趋势。总体来看，在功率为400W 时，超声辅助酸溶结晶的综合效益最高。溶质分子从溶液扩散到晶体表面，然后进入晶格，超声作用促进了扩散速率，使得成核时间降低，并增加了晶核的数量。杭方学等[25]采用超声处理研究溶析晶体时发现，在超声功率400W 以下时，超声波的功率越大，扩散系数越大，促进了分子间的混合，增强了不同相间的热质传递，结晶成核速率也越高。但是在高功率400W 以上，超声功率过大，导致产生晶体粒度过小，容易聚结，杂质进入结晶体里面，造成纯度下降，纯化的综合效益降低[26]。

图3 超声功率对结晶纯度和收率的影响

2.2.3 超声温度对超声结晶纯度与收率的影响

通过改变超声温度，得到的实验结果如图4所示。

图4 超声温度对结晶纯度和收率的影响

由图4 得知，当超声功率和时间一定时，随着超声温度的升高，收率呈下降趋势，这可能是由于随着超声温度的升高，核黄素的溶解度增加，使得析出的晶体减少，故收率有所下降；而对于纯度来说，随着超声温度升高，溶质分子运动加快，结晶速度减慢，杂质不易进入晶体中，同时“空化”作用产生的气泡能将杂质从晶体外表面赶走，减少杂质进入晶体造成各向生长异性，晶体析出杂质分子随之减少，因此纯度有所提升[26]，其综合效益总体趋势有所提高，50℃条件下综合效益最高。

通过超声辅助工艺的优化，相较于传统的种子结晶方法，超声辅助结晶能够降低诱导时间、过饱和浓度和亚稳态区域宽度，有效地促进混合控制结晶过程[27-28]。

综上所述。超声结晶的最佳实验条件为超声功率400W、超声时间40min、超声温度50℃，此时核黄素的收率可达到95%，纯度超过96%。

2.3 核黄素超声结晶后的表征分析

2.3.1 在光学显微镜下观察超声对核黄素结构的影响

未超声辅助结晶和超声辅助结晶后的核黄素光学显微图（40倍）如图5所示。

图5 未超声辅助结晶和超声辅助结晶后核黄素的光学显微图（40倍）

从图5可以很明显地看出，未经过超声得到的核黄素其形状呈针状，且有集聚情况。而经过超声处理后的核黄素形状发生了较大改变，晶习变短，且比较均匀。这是由于超声作用的引入，由于超声波的辐射、微射流以及局部高温高压提升了溶质分子混合的速率，降低了局部成核的数量，影响了晶体集聚的情况，解决了传统种子结晶方法工业放大过程中结晶后晶体集聚的问题[29-30]。为了进一步明确核黄素的晶体形状，通过电子显微镜确认。

2.3.2 在电子显微镜下观察超声对核黄素结构的影响

未超声辅助结晶和超声辅助结晶后核黄素的透射电镜图如图6所示。

图6 未超声辅助结晶和超声辅助结晶后核黄素的电镜透射图

通过透射电镜观察到，经过超声后的晶型发生了明显的变化，由原来的针状晶型转变为近似矩形，而且其内径变小，长度变短，长宽比变小，且相对均匀。超声作用下，由于超声的空化作用，溶质分子因其获得了充分的速度及能量，温度和浓度梯度减小，分子间的碰撞及相互加强，增加了穿过晶体表面静止液层的可能性，其更易于进入晶格，整齐排列，显著地增加了溶液传质速率和传质推动力[31]。

2.3.3 核黄素的XRD分析

核黄素的XRD 谱图如图7 所示。从图7 可见，经过超声作用后，随着超声时间的加长其峰强度有所增强。未超声核黄素的结晶度是79.56%，通过最优条件的超声处理后，结晶度提升至84.21%，结果表明，在超声作用下其结晶度有所改善。超声波引入到溶液结晶过程中，利用超声波的空化效应，能使过饱和溶液的成核诱导期缩短，大大减少结晶时间，当超声波频率增加时，晶体成核速度也会加快，成核诱导期变短。超声结晶能够简单有效地控制晶体成核数目及成核速度，形成的晶体晶形好、粒度分布均匀、晶体结构也完整。优化的超声辅助工艺条件可以有效地控制晶体大小、纯度、收率、结晶度和晶习[32]。

图7 超声功率为400W、不同超声时间下核黄素结晶的XRD谱图

3 结论

本文比较研究了溶剂析出法、溶剂析出结合酸溶法、控制结晶法、酸溶法和碱溶法等5种传统的结晶纯化方法的效果，其中酸溶法在收率和纯度指标上综合效益最佳。在此基础上添加超声辅助处理，其最佳的实验条件为超声功率为400W、超声时间为40min、超声温度为50℃，核黄素的收率可达到95%，纯度超过96%。超声辅助酸溶结晶进一步提高了核黄素的结晶度，易于成核，晶习更短，近似于矩形，晶体稳定，分散性能更好，易于压片成型，改善了应用加工和工业放大特性。