基于体外全仿生消化模型分析海带和紫菜中微量元素的生物可给性

赵艳芳，尚德荣，康绪明，翟毓秀，王联珠，盛晓风，丁海燕

（中国水产科学研究院黄海水产研究所 农业农村部水产品质量安全检测与评价重点实验室 山东青岛266071）

生物可给性（bioaccessibility）即污染物（或营养素）在胃、肠消化过程中从食物中溶出的比例，该部分代表食品中污染物（或营养素）可能为人体所吸收的最大量，是污染物（或营养素）最大经口生物有效性的指示[1-6]。对菲律宾蛤仔、缢蛏、鲍、牡蛎、血蚶等贝类体内金属元素的生物可给性的研究充分表明：与仅测定样品中元素的总量相比，分析元素的生物可给性更能准确反映水产品中必需元素对人体的可利用量，以及有害元素对人体的危害[6-7]。研究食品中元素的生物可给性，已成为未来食品风险评估的发展方向。

海带、紫菜等食用海藻富含多糖、蛋白、膳食纤维、不饱和脂肪酸、VB2和VB12以及人体必需的矿物质元素，并且具有控制体重，预防胃、肠和心血管疾病的功能[8-10]。海藻具有富集重金属的特性，是微量元素和矿物质的天然宝库，开展海藻中重金属的分析与生物可给性研究对于评估其食用安全性和营养价值都具有重要意义[11]。海带和紫菜一般都需加工熟后才能食用，加工前、后其微量元素的生物可给性存在差异，目前国内外相关研究还较少。体外全仿生消化模型是通过模拟人体消化液的组成、pH 值、两餐间隔时间和残留物滞留时间等模拟人类胃、肠道消化过程的一种简单方法，一般包括人体口腔、胃和肠3 步消化过程，是一种可重复测定食品中污染物生物可给性的有用工具[1-6，12]。本文采用体外全仿生消化法，以海带和紫菜为对象，研究新鲜海藻及经加工后可食状态的样品中人体必需元素（Cu、Fe、Mn、Zn、Sr 和V）和有害元素（As、Cd、Pb 和Al）含量的变化，并结合液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（HPLCICP-MS）分析As、Cd 等有害元素形态变化，分析海带和紫菜中关键微量元素的生物可给性，以期为科学评估海带和紫菜中必需微量元素的营养价值和有害元素的食用风险提供试验参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ELAN DRC Ⅱ电感耦合等离子体质谱仪，美国Perkin Elmer 公司；Series 200 高效液相色谱仪，美国Perkin Elmer 公司；Mars 6 型微波消解系统，美国CEM 公司；恒温振荡器，中国智诚公司；离心机，美国Thermo 公司。

牛血清白蛋白、黏液素、胃蛋白酶、胰酶、脂肪酶、牛胆汁粉、α-淀粉酶，美国Sigma 公司；氨基葡萄糖盐酸盐、葡萄糖醛酸、尿酸，国药集团；65%HNO3（优级纯），国药集团；多元素混合标准溶液（1 mg/L），上海市计量测试技术研究院；紫菜成分分析标准物质（GBW10023），国家标准物质中心。

1.2 样品制备

新鲜紫菜采集于江苏省南通市某养殖区，新鲜海带采集于山东省青岛市某养殖区。将新鲜紫菜和海带运回实验室后，用二次水漂洗3 次后，分成2 份：一份新鲜样品被剪碎后匀浆，待用；另一份新鲜样品经水煮15～20 min，达到可食状态，捞出、沥干后剪碎、匀浆，待用。

1.3 海带和紫菜仿生提取液的制备

参考文献[2]，制备胃和肠全仿生消化液，分别加入胃和肠中所含的有机物和无机物，调pH 值至各消化液对应的pH 值，分别加入相应消化酶，制备胃和肠全仿生消化液。震荡提取操作过程包括：称取新鲜和加工后海带和紫菜匀浆样品各4.0 g 于50 mL 离心管中，加入全仿生唾液6 mL，在37 ℃下恒温振荡5 min 后向消化食糜中加胃液12 mL，在37 ℃下恒温振荡2 h，消化食糜的pH 值为2～3，最后同时加入十二指肠液12 mL，胆汁6 mL 和2 mL HCO3-（1mol/L），在37 ℃下恒温振荡2 h 后，消化食糜的pH 值为6.5～7，仿生消化过程中振荡频率为250 r/min，保证消化食糜被完全旋转、振荡。该振荡提取方法得到的仿生消化结果与志愿者人体实验数据吻合[2]。消化结束后取10 mL全仿生消化液8 000 r/min 离心10 min，取上清用0.22 μm 滤膜抽滤，得全仿生提取液，沉淀为消化食糜残渣。

1.4 海带和紫菜样品及仿生提取液中无机镉离子（Cd2+）和As 的形态分析

取海带和紫菜样品匀浆组织约1.000 g，加入15 mL 二次水，涡旋混匀后，超声提取40 min，8 000 r/min，4 ℃离心10 min，吸取上清液过0.22 μm 滤膜。对于仿生提取液，直接取1.3 节滤液注入HPLC-ICP-MS 联用仪，分别对无机镉离子（Cd2+）和不同形态的砷进行定性和定量分析。无机镉的测定采用实验室建立的方法——液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICP-MS）[13]，液相色谱分离选用Dionex IonPac CS5A（4 mm×250 mm）阳离子交换色谱柱及保护柱CG5A（4 mm×50 mm）；流动相组成为50 mmol/L 草酸、95 mmol/L 氢氧化锂（pH 4.8），使用前过0.22 μm 滤膜并超声脱气15 min。砷形态测定参考国家标准GBT 23372-2009，采用HPLC-ICP-MS 联用技术分析样品及提取液中AsⅢ、AsⅤ、MMA 和DMA 共4种形态的As。液相色谱柱为阴离子保护柱Ion-PacAG 19（50 mm×4 mm）和阴离子分析柱Ion-PacAS 19（250 mm×4 mm）。

1.5 海带和紫菜样品以及消化食糜残渣中有益和有害微量元素测定

新鲜及加工后海带和紫菜样品中元素的测定参照食品安全国家标准 食品中多元素的测定GB5009.268-2016[14]。采用微波消解-ICP-MS 法，全仿生模拟消化后，经离心得到的所有残渣加入硝酸消解，消解完全后采用ICP-MS 测定必需微量元素与有害元素的含量。微波消化的前处理主要包括：准确称取1.000 g 样品于微波消解罐中，加入8 mL 浓HNO3浸泡24 h，采用微波消解仪进行消解和赶酸。微波消解程序包括：①爬升5 min，保持5 min，温度120 ℃，功率1 200 W；②爬升10 min，保持20 min，温度180 ℃，功率1 200 W；③爬升10 min，保持25 min，温度200 ℃，功率1 200 W；赶酸程序为爬升8 min，保持10 min，温度140℃，功率1 200 W。冷却至室温后，用二次水定容25 mL，混匀，备测。同时做试剂空白试验。

采用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定消化液中Cu、Fe、Mn、Zn、Sr、V、As，Cd，Pb 和Al等元素的含量，测定过程中在线加入10 ng/mL72Ge、103Rh、115In 混标溶液为内标元素，用于校正仪器响应信号的变化。ICP-MS 仪器射频功率1 500 W，射频电压1.20 V，等离子体气流量15 L/min，载气流量0.92 L/min，重复次数为3 次。以待测元素的浓度为横坐标，待测元素与相应的内标元素响应信号值的比值为纵坐标，绘制标准曲线。选择国家标准物质-紫菜成分分析标准物质（GBW10023）为质控样品保证元素检测的准确性。

1.6 生物可给性计算公式

海带和紫菜中微量元素的生物可给性，单位为%，按式（1）计算：

式中，Civ——海藻样品在全仿生消化后释放出的微量元素含量（mg/kg）；Ct——样品中微波消解后测定的微量元素总含量（mg/kg）。

1.7 数据统计与分析

结果用平均值±标准差表示，采用SPSS 13.0进行相关性分析，P＜0.05 为有显著性意义，采用Origin 8.0 作图。

2 结果与讨论

2.1 元素测定方法准确度验证

用本试验方法测定紫菜成分分析标准物质（GBW10023）中Cu、Fe、Mn、Zn、Co、V、As，Cd，Pb、Al 和Sr 等元素的含量，结果见表1。试验结果表明本方法测定样品中元素的准确度好，结果可靠。

表1 紫菜成分分析标准物质（GBW10023）中元素含量测定结果（平均值± 标准偏差，n=5）Table 1 Detection of the certified reference materials of Laver（GBW10023）（±s，n=5）

表1 紫菜成分分析标准物质（GBW10023）中元素含量测定结果（平均值± 标准偏差，n=5）Table 1 Detection of the certified reference materials of Laver（GBW10023）（±s，n=5）

元素参考值实测值元素参考值实测值Cu/mg·kg-112.2 ± 1.112.52 ± 0.46As/mg·kg-127 ± 625.32 ± 2.44 Fe/g·（100g）-10.145 ± 0.010.142 ± 0.0058Cd/mg·kg-10.57 ± 0.050.58 ± 0.033 Mn/mg·kg-168 ± 366.98 ± 1.52Pb/mg·kg-12.05 ± 0.152.08 ± 0.085 Zn/mg·kg-128 ± 228.98 ± 0.77Al/g·（100g）-10.49 ± 0.080.45 ± 0.026 Co/mg·kg-10.63 ± 0.050.616 ± 0.022Sr/mg·kg-124 ± 225.07 ± 0.62 V/mg·kg-14.2 ± 0.64.07 ± 0.36

2.2 海带和紫菜中有益微量元素的含量和生物可给性

紫菜中6 种人体必需微量元素的含量均显著高于海带样品（见表2）。可见，煮熟后海带和紫菜中6 种对人体有益的必需微量元素含量均表现出下降趋势。差异性分析显示，除海带中Cu 和V 含量下降不显著（P＞0.05）外，海带中其余4 种元素含量及紫菜鲜样中6 种有益元素的含量均呈显著下降趋势（P＜0.05）。其中紫菜中Fe、Mn 和Co 的含量变化最显著，降至新鲜样品时的1/3。

表2 海带和紫菜样品及仿生消化后海藻残渣中必需微量元素的含量（mg/kg，n=3）Table 2 Total content of essential trace metal in the sample and residue of seaweed（mg/kg，n=3）

新鲜与加工熟后海带和紫菜中有益必需元素的生物可给性见表3。对于新鲜海带，在所分析的6 种有益元素中，Co 的生物可给性最高，且加工前、后的生物可给性变化较小，而V 的可给性最低，约2%，其次为Cu 和Fe。经煮熟后，Cu 和V 的生物给性升高，分别由15.4%和2.7%增至25.0%和31.4%，说明海带煮熟后，Cu 和V 在胃、肠仿生消化过程中的溶出率显著增加；而Fe 和Zn 的生物可给性明显下降，分别从新鲜样品中的14.8%和26.8%降至3.0%和5.9%，说明经胃、肠仿生消化，加工后海带中可供人体吸收的Fe 和Zn 的比率显著下降。与海带不同，紫菜中Cu、Fe、Mn、Co和V 的生物可给性相似，均＞60%，Zn 的生物可给性最低，为18%。加工前、后，紫菜中元素的生物可给性变化较小，说明紫菜中有益元素更易于被人体胃、肠消化液溶出。

大型海藻富含Fe、Mn、Cu、Zn、Co 等人体必需微量元素，其含量约比陆地植物高10 至100 倍，为人类提供丰富的矿物质元素来源[15-16]。其中Fe是人体多种生命代谢过程的主要成分，包括参与氧气运输、电子传递和氧化酶活性等；Mn 是许多生物酶，如超氧化物歧化酶、精氨酸酶和丙酮酸羧化酶等的辅助因子，Mn 也参与氨基酸、脂质和碳水化合物的代谢；Cu、Zn 也是许多生物酶的主要组成，包括神经传递合成，能量代谢等；Co 参与VB12合成等[17-18]。本研究结果显示紫菜中必需微量元素的含量均高于海带，尤其富含Fe，其次为Mn，该研究结果与已有结果相似。Dawczynski 等[19]分析了中国紫菜中Fe 的含量为991 mg/kg（湿重），约为日本、韩国紫菜的7 倍。Astorga-España等[20]研究提出红藻富含Fe，且红藻中Mn 的含量普遍高于褐藻[19，21-22]。

目前关于海藻中必需元素的生物可给性研究较少。体外全仿生消化法分析扁浒苔（Ulva compressa）中Fe 的生物利用率为55%～56%[23]，添加维生素C 能提高Fe 的生物利用率[24]。蕨藻、裙带菜、海带、裙带菜、面条藻、海白菜、紫菜中Mn 的生物可给性较高，均大于60%[25-27]，与本研究中紫菜的结果相似。加工后海藻Mn 的可给性降为18.2%[28]。裙带菜（Undaria pinnatifida）中Co 的生物利用率为33%～78%，掌叶树（Palmaria palmata）中V 的生物利用率最高为61%[29]，与本研究结果相近。已有的关于海藻中Cu 的生物可给性研究显示蕨藻中为44.3%～56.3%，紫菜为59.5%，海带为66.5%，裙带菜为75.8%，面条藻为62.5%，海白菜为67.2%，紫菜为59%[25-27]，其中紫菜的研究结果与本研究结果相似。本研究的海带中Cu 的生物可给性较低，为25.0%，低于已有的报道。海藻中Zn 的生物可给性研究表明：蕨藻为37.7%～47.4%，紫菜为59.1%，海带为49.9%，裙带菜为37.8%，面条藻为64.5%，海白菜为41.8%[25-27]。而本研究结果显示海带和紫菜中Zn 的生物可给性最低，低于30%，远低于已有的研究报道。本结果表明：加工对紫菜中元素生物可给性的影响较小，而对海带的影响较大，其中Fe 和Zn 显著降低，这可能是由于未加工的海藻中富含90%的膳食纤维，提高了元素的生物可给性[26，28]。

表3 海带和紫菜样品中有益必需元素的生物可给性（%）Table 3 Bioaccessibility of essential trace metal in the sample and residue of seaweed（%）

2.3 海带和紫菜中有害微量元素的含量和生物可给性

本试验选择的新鲜紫菜中Pb、Cd、As 和Al 的含量远高于海带，经煮熟后，海带中Pb、Cd 和As的含量差异均不显著（P＞0.05），而紫菜中4 种有害元素的含量均显著下降（P＜0.05）。从表4 可见，海带中Pb 的生物可给性最低，Cd 和As 的生物可给性最高，其次为Al。煮熟后，海带中Pb 的含量下降，其生物可给性也由20.6%降至6.7%，Cd 和As 的含量和生物可给性均没有明显变化，Al 的含量显著下降，而生物可给性没有变化。紫菜中Pb的生物可给性最低，Cd，As 和Al 的生物可给性相似。总结可得海带和紫菜中Pb 的含量较低，在胃、肠仿生消化过程中的溶出率也最低，而Cd、As 和Al 的生物可给性较高。海带中Sr 的含量远高于紫菜，然而两种海藻Sr 的生物可给性相似，60.2%～67.5%，且加工前、后几乎没有变化。

红藻比褐藻具有较强的富集微量元素的能力[11]。本试验也表明紫菜中镉、铅等有害元素的含量显著高于海带（前者约为后者的10 倍）。蕨藻中Cd 的生物可给性为41.8%～46.7%，裙带菜为77.5%，海苔为56.1%，海带为78.9%，裙带菜为100.2%，面条藻为66.7%，海白菜为64.7%以及加工后海藻为24.0%[25-27]。本研究中新鲜海带与加工熟后海带中Cd 的生物可给性分别为90.6%和77.4%，紫菜中分别为73.4%和74.6%，与已有研究结论相似。本试验证明海带和紫菜中As 的生物可给性较高（71.7%～84.8%），与紫菜（Porphyra abottae）中As的生物可给性（79±7）%[25]相似。海藻中As 的生物可给性高，可能是由于As 在海藻中主要以砷糖形态存在，而这些砷糖的水溶性很高，因此As 在胃、肠仿生消化液中的溶出率较高。有关海藻中Pb 的生物可给性研究非常少，仅查到蕨藻中为22.3%～32.0%[27]，墨角藻中为9%[30]，研究结论与本研究结果相似。总之，Pb 的生物可给性远低于Cd、As、Sr和Al。海藻中Pb 的生物可给性较低，可能是因为海藻中的Pb 主要以无机Pb（Ⅱ）形式存在[31]，且主要是难溶的无机铅盐形态，所以在胃、肠消化液中的溶出率较低。适量的锶（Sr）能促进血管内皮和骨细胞的增殖，降低血管紧张性和抑制破骨细胞形成，而过量摄入锶能够引起人机体急慢性损伤，包括神经调节功能、心血管功能和免疫功能障碍等[32]。本研究表明海带和紫菜具有较强的富集Sr 的能力，且海带中的含量高于紫菜。蕨藻中Sr的含量为230 mg/kg（干重）[33]。仅查阅到一篇有关海藻中Sr 的生物可给性研究，指出岸生根枝藻（Rhizoclonium riparium），肠浒苔（Ulva intestinalis），孔石莼（Ulva lactuca），浒苔（Ulva prolifera）中Sr 的生物可给性均大于60%[30]，与本试验的海带和紫菜中Sr 的生物可给性一致。海带中Al的生物可给性为57%，略低于紫菜（加工前、后分别为75.3%和67.5%）。目前有关海藻中Al 的生物可给性研究尚未见报道。Al 是一种低毒的微量元素，进入人体蓄积后能介导骨骼毒性、神经毒性、免疫毒性、生殖毒性等。由于海藻中Al 以不同赋存形态存在[34]，因此有关海藻中Al 的生物利用率及在胃、肠消化过程中的形态转化需引起关注。

表4 海带和紫菜样品及仿生消化后海藻残渣中有害微量元素的含量（mg/kg，n=3）和生物可给性（%）Table 4 Total content（mg/kg，n=3）of toxic trace metal in the sample and residue of seaweed and its bioaccessibility（%）

2.4 仿生消化前、后海藻中无机离子态Cd 和As的形态

根据2.3 节结果，海藻样品中Cd 和As 的生物可给性较高。进一步研究了新鲜及加工后海带和紫菜样品及仿生消化液中Cd 和As 的赋存形态，针对毒性最高的无机离子态Cd2+和As 的形态进行分析。

从图1 可见，紫菜样品中As 的形态主要为大分子有机砷糖（出峰时间2.8 min）和DMA，未检出无机砷，而在仿生消化液中，As 的形态主要为出峰时间2.57 min 的大分子有机砷糖，以及一个出峰时间为4.5 min 的未知砷形态，未检出无机砷及DMA。比较新鲜紫菜与加工后样品及其仿生消化液中As 的形态变化，主要体现在大分子有机砷糖的含量变化。

海带样品中As 的形态主要是DMA 和大分子有机砷糖（出峰时间为2.58 min），未检出无机砷（AsⅢ和AsⅤ）（见图2）。煮熟后海带中As 的形态变化主要是大分子有机砷糖含量降低，而DMA 含量没有变化。在仿生消化液中，鲜样和加工煮熟后样品中As 的形态除DMA 和大分子有机砷糖外，还检出三价无机砷（AsⅢ）以及一个出峰时间为4.5 min 的未知形态，其中三价无机砷的含量为0.048 mg/kg，说明在胃、肠消化过程中，海带中As形态发生转化，部分有机砷转化成无机砷，并且鲜样与加工后海带消化液中As 的形态变化主要体现在有机砷糖含量的变化，而DMA 和三价无机砷的含量没有变化。

图1 紫菜鲜样（加工前）与加工煮熟后样品及仿生消化液中As 的赋存形态Fig.1 Arsenic species in the fresh and cooked samples and gastrointestinal juices of Porphyra yezoensis

图2 海带鲜样（加工前）与加工煮熟后样品及仿生消化液中As 的赋存形态Fig.2 Arsenic species in the fresh and cooked samples and gastrointestinal juices of Laminaria japonica

有研究表明海带和紫菜样品中的As 主要为有机砷形态，几乎不含或含很少的无机砷[35-37]，而在胃、肠消化液的作用下，海带和紫菜样品中As的形态会发生显著变化，包括部分形态的有机砷在消化过程中转化成无机砷。这可能是由于胃、肠消化酶通过影响消化过程，影响微量金属配合物的配体组成，从而对海藻中微量元素的形态和生物可给性产生明显影响[38]。煮熟过程不会改变样品及消化液中As 的形态，As 含量的降低主要表现在大分子有机砷糖含量的降低。

图3 和图4 是紫菜和海带样品及其仿生消化液中Cd2+的含量分析。从图3 可见，紫菜新鲜样品中含有一定的无机离子态Cd2+（0.025 mg/kg），煮熟后，在样品中未检出无机Cd2+。经胃、肠全仿生消化后，新鲜样品仿生消化液中含有一定的无机态Cd2+，而加工后样品和仿生消化液中无Cd2+检出，说明新鲜紫菜样品经煮熟，能显著降低无机离子态Cd2+的含量，提高其食用安全性。从图4 可见，对于海带样品，新鲜或加工煮熟后的海带样品和仿生消化液中均未检出无机Cd2+。

图3 紫菜鲜样（加工前）与加工煮熟样品及仿生消化液中Cd2+的赋存形态Fig.3 Cd2+ analysis in the fresh and cooked samples and gastrointestinal juices of Porphyra yezoensis

图4 海带鲜样（加工前）与加工煮熟后样品中及仿生消化液中Cd2+的形态分析Fig.4 Cd2+ analysis in the fresh and cooked samples and gastrointestinal juices of Laminaria japonica

镉、铅等有害元素在生物体及环境中具有不同的赋存形态，而重金属元素的毒性取决其化学形态，通常有机铅化合物的毒性大于无机铅化合物[31]，无机离子态镉的毒性一般认为大于有机态镉[39]。海藻中Cd 的化学形态主要是有机结合态或难溶于水的形态，离子态镉含量很低[39]。海藻全仿生消解液中Cd 的有机形态研究表明主要以谷胱甘肽-Cd、植物螯合肽-Cd 等形态存在[40]。本试验表明在新鲜紫菜样品的水提液及仿生消化液中均检出无机离子态Cd2+，而煮熟后样品及仿生消化液中均未检出，可能是在加热过程中紫菜组织中可溶的无机离子态镉释放并转移到水中，因此煮熟能显著降低紫菜样品中无机离子态Cd2+的含量，而海带中总镉含量没有变化，说明本试验选用海带样品中的镉主要是有机态镉，可溶的无机离子Cd2+含量非常低。运用全仿生消化模型可以准确反映海藻中人体必需元素与有害元素的生物可给性，科学评估海藻中人体必需元素的营养价值及有害元素的食用风险。

3 结论

不同海藻中微量元素的含量与生物可给性存在显著差异。海带中必需微量元素的生物可给性普遍低于紫菜，加工煮熟后海带中不同微量元素的生物可给性变化不同，而紫菜中的变化较小，2种海藻中Zn 的生物可给性最低。对于有害元素，海带与紫菜中Pb 的生物可给性最低。煮熟过程不会影响海带和紫菜中As 的主要形态，其总含量的降低主要是大分子砷糖含量的降低。胃、肠消化可能影响海带和紫菜中As 的形态转化，部分有机砷可能转化成无机砷。新鲜紫菜样品加工煮熟后自由态无机离子Cd2+含量明显降低。有关海藻中Sr和Al 的生物可给性及其生物有效性在今后的研究中需得到关注。