线粒体DNA变异在胃癌中的研究进展

杨 婷，于景翠

哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心，黑龙江 哈尔滨 150081

线粒体是细胞进行有氧呼吸、钙信号传导、细胞代谢调节、血红素合成、类固醇合成以及细胞凋亡的关键场所[1]。线粒体较为独特，有自己的基因组，同时受两套遗传体系即核基因组(nuclear DNA，nDNA)和线粒体基因组(mitochondrial DNA，mtDNA)的共同调控。虽然mtDNA只编码13种多肽，但他们是细胞能量生成的关键组成部分[2]。在哺乳动物细胞中，线粒体可以通过氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)提供大部分能量[3]。除此之外，线粒体也是产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)的主要场所，ROS可以调节细胞功能，包括自噬和抗菌作用，并在细胞分化等途径中充当信号分子。生理条件下，细胞内ROS的产生和降解之间处于平衡状态，但若线粒体功能障碍导致OXPHOS系统效率低下，产生高水平的ROS，并且由于mtDNA自身的结构特征，会造成mtDNA的氧化损伤和/或发生突变，影响细胞的正常功能，从而引发包括肿瘤在内的一些相关疾病[4-6]。

1 mtDNA结构特征

mtDNA是长约16.5 kb的双链环状DNA，由编码区和非编码区组成[7]。编码区共编码包括22种转运RNA、13种多肽、2种核糖体RNA在内的37个基因；13种多肽包括复合体Ⅰ中的7种亚基(ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6)，复合体Ⅳ中的3种亚基(COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ)，复合体Ⅴ中的2种亚基(ATP合成酶6和ATP合成酶8)和复合体Ⅲ中的细胞色素b(cytb)[8]。非编码区也称D-环区(D-loop)，是mtDNA转录和复制的调控区域[9]；尽管D-loop区在mtDNA中的占比很少，却是mtDNA突变的热点区域，包含3个高变区(hypervariable regions,HVR)：位于mtDNA序列上(np)16024～16383的HVRⅠ、(np)57～372的HVRⅡ和(np)438～574的HVRⅢ[10]。

哺乳动物每个细胞的线粒体基质中含有几千个mtDNA拷贝，这为mtDNA的高突变率提供了结构基础[11]。传统意义上认为与nDNA相比，mtDNA由于分子量小、缺乏组蛋白的保护、长期暴露于ROS的环境中、缺乏有效的修复机制，因此mtDNA易受ROS的损伤而发生变异[12]。虽然近年来也发现线粒体转录因子A(TFAM)发挥类似组蛋白的保护作用，尽管线粒体缺乏核苷酸切除修复(NER)和有效的同源重组，但保留了碱基切除修复(BER)和单链断裂修复机制。尽管如此，研究发现mtDNA仍具有高突变率，导致多种疾病的发生[13]。此外，在整个细胞周期过程中mtDNA始终处于合成状态，稳定性差，容易受到外界干扰而发生变异；且参与mtDNA复制的DNA聚合酶γ的校对能力较差，位于轻链复制起源部位的tRNA基因序列易形成发夹样结构使得mtDNA复制的错配率明显提高[14-15]。mtDNA无内含子，基因间隔近，有些区域呈现重叠[16]。

mtDNA的这些结构特征使其自身更容易受环境影响而发生突变，mtDNA任何位点的突变均可能会影响线粒体的氧化磷酸化功能，使线粒体呼吸链功能障碍从而导致包括胃癌在内的肿瘤的发生发展[17]。

2 mtDNA变异与胃癌的关联

胃癌的复杂演变过程不仅与癌基因和抑癌基因的改变有关，还与mtDNA的变异相关[18]。目前已在胃癌中检测出几种类型的mtDNA变异，包括点突变、插入、缺失和拷贝数变化。

2.1 mtDNA点突变与胃癌大量关于体细胞变异的研究均发现D-loop区域是体细胞变异的热点区域[19]。Lee等[20]采用测序分析31例胃癌组织，发现有20例胃癌至少携带一个mtDNA体细胞突变位点，其中69%的突变发生在mtDNA D-loop区域，27%在蛋白质编码区域，4%位于tRNA基因中。发生在mtDNA D-loop区点突变的频率为4%～48%，其中最常见的点突变位于mtDNA D-loop区上核苷酸位置303～309 np(D310区)的poly-C序列碱基[21]。有分析认为，由于在线粒体中缺乏有效的类似nDNA所具有的多种DNA修复机制，从而导致在癌症中高频率发生D310区突变[22]。此外，对poly-C重复序列的氧化损伤还会降低线粒体DNA聚合酶γ在复制和修复mtDNA过程中的准确性，使核苷酸错误插入率升高，进而导致细胞的mtDNA发生点突变[23]。

在胃癌中除了D-loop区，mtDNA编码区也存在体细胞突变。Hung等利用测序技术分析31例胃癌组织，其中7例癌组织mtDNA编码区中有8个体细胞突变，包括同质性5个点突变(G3697A、G4996A、G9986A、C12405T、T13015C)和异质性3个突变(5895delC、7472insC、12418insA)，这些突变中有4个(4/8，50%)在mtDNA高度保守区域可导致氨基酸改变，可能引发线粒体功能障碍[24]。

2.2 mtDNA插入与胃癌在mtDNA D-loop区发生的串联重复序列插入已经在线粒体肌病、老年受试者和具有特定mtDNA单倍群的高加索人群中被检出，由于所发现的大部分mtDNA插入突变呈随机性，因此有研究者[25-26]认为在肿瘤中检测出的mtDNA D-loop区重复性插入并非癌症特异性的。Wu等[25]采用PCR和测序分析31例胃癌组织，发现1例mtDNA D-loop区有一个约260 bp的串联重复插入片段，其两侧分别是位于(np)303～309和(np)568～573的poly-C序列。同样，Hung等[26]在约5%患有不同类型癌症(包括胃癌)患者的癌组织中检测出mtDNA的串联重复或三联重复，但在癌症患者相应的非癌组织和正常受试者的外周血细胞中也检测出该串联重复或三联重复，因此认为在mtDNA D-loop区域中发生的串联重复或三联重复是不特定于癌症的；此外，研究者还发现mtDNA中的串联重复或三联重复与D-loop中的(np)568附近poly-C延伸区的长度变化密切相关。

2.3 mtDNA缺失与胃癌迄今为止，人们已经在肿瘤中发现了大量的mtDNA缺失，最常见的是mtDNA 4 977 bp大片段缺失[27]。经定量PCR和测序技术比对分析52例胃癌组织及相应癌旁组织、13株胃癌细胞系的mtDNA 4 977 bp缺失，缺失率分别为73.1%、52%和92.3%，提示我们发生在mtDNA的大片段缺失对胃癌有一定的影响[28]。而与之相反的结果，Wu等在胃癌组织中检测出4 977 bp的缺失率为9.7%，正常组织为55%[25]。同样，Dani等[29]发现，胃癌组织mtDNA 4 977 bp缺失率明显低于癌旁组织，推测mtDNA 4 977 bp大片段缺失可能会抑制癌细胞的增殖。对于上述的争议性结果，有分析认为，尽管随着年龄的增长，mtDNA大片段缺失会在体细胞中逐渐积累，且环境因素(例如阳光照射)也会增加mtDNA缺失水平[30]。然而，在大多数肿瘤组织中mtDNA缺失水平明显低于相应癌旁组织的这种现象提示mtDNA的大片段缺失可能发生在细胞转化之前或肿瘤发生的早期阶段，并且因mtDNA大片段缺失可能使肿瘤细胞对凋亡更敏感，从而消除了mtDNA缺失水平高的肿瘤细胞[31]。除了mtDNA大片段缺失之外，一些较小的mtDNA缺失片段(<1 kb)似乎在肿瘤组织中会大量积累，而在同一患者的邻近非肿瘤组织中不积累。通过采用PCR-SSCP技术分析77例胃癌组织中mtDNA D-loop区，Burgart等发现4例发生在胃-食管交界处的癌组织中均存在一个高水平的50 bp片段缺失，其侧翼是D-loop区(np)298～306和(np)348～356的9 bp重复序列，而在淋巴细胞和其远端的胃黏膜和组织中未发现该缺失[32]。

2.4 mtDNA拷贝数变化与胃癌目前，mtDNA拷贝数的变化已被发现包括胃癌在内的多种类型肿瘤中，mtDNA拷贝数既有高也有低，但究竟是mtDNA含量的升高还是降低是决定肿瘤发生发展的危险因素尚无明确定论。Wen等采用定量PCR技术检测了76例胃癌组织，结果显示肿瘤组织中相对mtDNA拷贝数明显少于相应癌旁组织，ATP产物也显著减少，认为mtDNA拷贝数的减少可以作为胃癌发病风险的一项指标[33]。类似的结果，韩琤波等利用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)银染分析20例胃癌组织mtDNA D-loop区的HVRⅠ和HVRⅡ，表明HVRⅠ和HVRⅡ的拷贝数在癌组织中明显降低，由此认为胃癌与细胞内mtDNA拷贝数的降低有密切关系，mtDNA可能会成为一种新兴的肿瘤分子标志物[34]。然而，Lee等报道,胃癌组织较癌旁组织mtDNA的拷贝数高，但两者间差异并无统计学意义，也并未发现mtDNA拷贝数与胃癌的临床病理特征之间存在关联[35]。人类线粒体转录因子A(TFAM)由核基因TFAM编码，在mtDNA转录、复制和包装成类核中起重要作用，在线粒体生物发生过程中发挥关键作用[36]。TFAM可通过维持mtDNA的稳定性来调节mtDNA拷贝数，通过TFAM与mtDNA的相互作用来调节线粒体的生物发生[37]。Lee等采用TFAM-siRNA感染胃癌细胞MKN45敲低癌细胞中的TFAM水平，并通过定量PCR检测mtDNA拷贝数，发现敲减TFAM会降低mtDNA拷贝数水平，进而通过TFAM-mtDNA-Ca2+-CFAP65-PCK1轴参与线粒体逆行信号传导，影响胃癌细胞的分化，下调胃癌细胞的增殖，提出消耗mtDNA将是针对TFAM相关胃癌的有效治疗方法[38]。

3 mtDNA变异导致肿瘤发生发展的相关机制

mtDNA损伤引发癌变的机制非常复杂，尽管在多种肿瘤中均发现mtDNA的改变，但其致癌的具体机制仍未明确。作为细胞内主要供能场所，线粒体可消耗人体95%以上氧量，在氧化磷酸化过程中有2%～4%的氧转化成ROS，NADPH氧化酶1(Nox1)也会产生大量的ROS[39]。一般情况下，这些ROS能够被机体自身的抵御系统及时清除，但当自身的抵御系统功能减弱或ROS生成过多时，ROS未被清除而累积在细胞内，就会损伤mtDNA从而导致mtDNA发生突变；mtDNA突变又会导致呼吸链酶编码基因异常，影响呼吸链中电子传递的过程，减弱呼吸功能，产生大量内源性的ROS，从而引发恶性循环；大量的ROS还可诱发原癌基因成为癌基因，还可刺激肿瘤细胞不断增殖，以上这种机制被认为参与了肿瘤的发生发展[40]。

目前，已经在多种癌症中发现mtDNA含量减少伴随p53的突变。作为一种重要的肿瘤抑制转录因子，在ROS造成mtDNA损伤时，p53能够抑制肿瘤形成，且进入线粒体作用于mtDNA聚合酶，增强mtDNA的复制能力，因此p53的突变或缺失会造成mtDNA含量减少[41]。Yeung等在胶质母细胞瘤细胞系中鉴定了大量的mtDNA突变体，发现mtDNA突变体的积累会导致电子转移链功能失调，从而促进细胞由有氧糖代谢转变为无氧糖酵解，导致肿瘤细胞的增殖[42]。

另外，mtDNA的片段也可能通过整合到nDNA中的方法参与肿瘤的形成。细胞受到有害刺激时，线粒体发生崩解，细胞质中游离的mtDNA及其片段增多，如果此时机体不能及时清除游离mtDNA，在一定条件下这些游离mtDNA及其片段就会进入细胞核，与nDNA随机整合，基因整合可导致核基因组不稳定，使信号传导异常，细胞增殖分化紊乱从而导致肿瘤的发生[43]。

4 展望

综上所述，mtDNA变异在胃癌的形成及进展中发挥重要作用，这是由于mtDNA作为细胞核外唯一的遗传物质，具有独特的自身结构和特征，相比nDNA更易于发生氧化损伤和变异。然而，值得注意的是虽然在胃癌中发现了多种mtDNA突变，但仍未找到mtDNA突变与胃癌发生最具直接因果关系的有力证据；尽管已在包括胃癌在内的多种类型肿瘤中发现mtDNA拷贝数变异，但究竟mtDNA含量的升高或降低是决定肿瘤发生发展的危险因素仍无明确定论。值得庆幸的是，目前针对mtDNA变异在基础研究和临床应用(实验室常规检测等)方面，现在已经能够利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑，定点敲除以实现mtDNA缺失类型的诱变；通过调节TFAM基因实现对线粒体拷贝数的诱变，以此为临床提供更多的思路。但在技术上仍然存在一定的局限性，尚无有效准确的技术手段对mtDNA进行插入类型的诱变，在临床上也无法开展大规模的mtDNA测序工作，缺乏标准化的实验室操作流程，这些均是mtDNA变异在包括胃癌等肿瘤研究和临床应用中所面临的挑战。最近Zhao等已率先构建了靶向线粒体circRNA的纳米递送系统，实现了在体内外干预线粒体定位circRNA，为靶向线粒体信号治疗代谢性免疫疾病提供了新思路[44]。相信随着分子生物学技术的不断发展和进步，mtDNA变异在胃癌中发挥的作用及其相关机制也会逐渐清晰，对于胃癌靶向治疗将提供更加具有针对性的方法。