高迁移率族蛋白B1、基质金属蛋白酶-9及血管内皮生长因子在肺癌患者组织中的表达及临床意义研究

冯 为

(佳木斯中心医院 胸外科,黑龙江 佳木斯154000)

近年来，肺癌的患病率及病死率呈现逐年升高的变化趋势，虽采取相应的治疗，但患者生存率及生存周期均较小，对患者生命健康造成较大的威胁。特别是对于非小细胞肺癌而言，即使经积极治疗，但是仍会复发甚至癌症病灶存在远处转移的问题，严重困扰着临床医师。相关文献报道称：多种基因参与调控肺癌的侵袭转移过程[1-3]。高迁移率族蛋白B1(High mobility group box1,HMGB1)属于一组非组蛋白的核蛋白，目前已发现其参与了多种恶性肿瘤的侵袭以及转移过程中[4]；基质金属蛋白酶-9(Matrix metallopmteinase-9，MMP-9)作为基质金属蛋白酶家族中相对分子质量最大的一种蛋白酶，也参与了恶性肿瘤的浸润以及转阴过程中[5]，其可能机制为：由于在较大的肿瘤组织内部，坏死的肿瘤细胞会释放出大量的HMGB1并作用于纤溶系统，对基底膜以及细胞外基质产生破坏所致。恶性肿瘤细胞可经自分泌或旁分泌的血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)诱使肿瘤淋巴管产生，从而加快肿瘤细胞的侵袭与转移过程。HMGB1能够对核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)蛋白及丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)等信号通路具有激活作用，这些信号路径已在某些恶性肿瘤中证实与MMP-9及VEGF地表达调节相关[6-7]。目前，临床关于HMGB1、MMP9以及VEGF同时在肺癌组织中的表达情况及其与病理学关系方面的研究报道尚较少。本研究主要通过分析如上内容，旨在探讨上述3种因子在肺癌组织中的表达意义及其可能作用机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2017年11月至2019年11月期间佳木斯中心医院收治的90例肺癌患者作为研究对象，对术中所切除的肺癌组织及其癌旁组织进行收集。入选标准：(1)均经术后病理学检查确诊，且均为初次确诊；(2)经术后生存期评估，患者生存期在3个月以上；(3)患者对本研究方案知情同意，且经医院伦理委员会批准(审批号：SP20171025)。排除标准：(1)既往接受放、化疗治疗；(2)合并其他恶性肿瘤疾病患者；(3)严重的心肝肾等器质性病变者；(4)中途死亡退出研究者。本研究入选的90例肺癌患者中，男、女分别为51例、39例；年龄48-78岁，平均(64.52±10.22)岁；组织学类型：腺癌、鳞癌分别为47例、43例；淋巴结转移49例；分化程度：高、中、低分化例数分别为25例、38例、27例。本研究中所获取的肺癌组织及其癌旁组织标本均于手术切除之后立即予以处理，以有效规避因组织细胞的结构、化学成分、物理性质等的改变而对实验结果产生的影响，将标本置于浓度为10%的福尔马林溶液(pH=7.0)中进行固定，采用石蜡包埋之后连续进行切片处理。

1.2 免疫组化方法首先取切片，将其烘烤1 h，应用二甲苯Ⅰ、Ⅱ对其进行脱蜡处理，使用浓度梯度分别为100%、95%、80%及70%的酒精进行水化处理，自来水重复冲洗2次，5 min/次。滴加浓度为3%的双氧水，在避光条件下孵育10 min，采用PBS冲洗3次，3 min/次。然后将其浸入枸缘酸钠缓冲液之中，使用高压锅修复抗原热，并于山羊血清中封闭1刻钟。使用滤纸将血清吸去，将已稀释好的一抗滴加进去(HMGB1、MMP-9及VEGF多克隆抗体均购自于上海钦诚生物科技有限公司)，于4℃温度条件下过夜进行处理，并于室温状态下放置1 h，PBS重复冲洗2次，5 min/次，将生物素化的二抗滴加其中，于37℃温度条件下反应20 min，再次使用PBS重复冲洗2次，5 min/次，向其中加入链霉亲和素-生物素复合物(strept avidin-biotin complex,SABC)，于37℃条件下静置20 min，采用PBS重复冲洗2次，5 min/次。DAB显色，苏木素溶液复染10 min，采用盐酸酒精分化处理。采用浓度分别为80%、95%、100%、100%的梯度酒精进行脱水处理，然后使用二甲苯Ⅰ、Ⅱ进行透明处理，将一定量的中性树胶滴入其中，封片晾干。

1.3 结果判定对于每个手术切片随机选取8个视野，于高倍镜(×400)下进行观察。HMGB1、VEGF细胞核与细胞质呈现出棕黄色为阳性，MMP-9细胞质呈棕黄色为阳性。对每个视野下的HMGB1及VEGF阳性细胞数量进行统计分析，对其阳性细胞率进行计算，对8个视野下的阳性细胞率平均水平进行计算，阳性细胞率大于20%则计为阳性。MMP-9阳性结合染色强度以及阳性细胞率进行综合判定：阳性细胞率<10%，记为1分；阳性细胞率在[10%,50%)，记为2分；阳性细胞率≥50%，记为3分；染色强度：无染色、淡黄色、黄色及棕黄色分别记为0分、1分、2分及3分。最终得分=阳性细胞率得分×染色强度得分，如果最终得分在3分以下，则表示为阴性，最终得分≥3分，则表示为阳性。

1.4 观察指标(1)比较肺癌组织与癌旁组织HMGB1、MMP-9及VEGF阳性表达情况；(2)肺癌组织中HMGB1、MMP-9及VEGF的表达与病理学相关指标的关系。

2 结果

2.1 癌组织与癌旁组织中的HMGB1、MMP-9及VEGF阳性表达对比肺癌组织中的HMGB1、MMP-9及VEGF阳性表达率分别为63.33%、68.89%及66.67%，均分别显著高于癌旁组织(分别为30.00%、31.11%及2.22%)(P均=0.000)，见表1。

表1 肺癌组织与癌旁组织中的HMGB1、MMP-9及VEGF阳性表达情况比较[n(%)]

2.2 肺癌组织中HMGB1、MMP-9及VEGF的表达与临床病理学特征的关系肺癌组织中有淋巴结转移、腺癌HMGB1、MMP-9及VEGF阳性表达率均分别显著高于无淋巴结转移、鳞癌(P均<0.05)，但肺癌组织中上述因子阳性表达率与年龄、性别、肿瘤直径及分化程度无关(P均>0.05)，见表2。

2.3 肺癌组织中HMGB1、MMP-9及VEGF表达的相关性分析经Spearman相关性分析，结果显示：肺癌组织中HMGB1阳性表达率与MMP-9及VEGF呈正相关性(r值分别为0.459、0.445，P均<0.01)；MMP-9阳性表达率与VEGF呈正相关性(r值为0.422，P<0.01)。

表2 肺癌组织中HMGB1、MMP-9及VEGF的表达与临床病理学特征的关系

3 讨论

我国肺癌的发病呈逐年上升趋势，肺癌出现侵袭及转移，加大了治疗的难度，癌细胞的远处转移是造成患者死亡的一个重要原因[8-9]。本研究入选90例肺癌患者中，出现淋巴结转移的患者49例(占54.44%)。因此，加强对肺癌患者机体相关因子表达情况及其与临床病理学之间的关系、各因子间的相关性，对临床诊疗及弄清疾病可能发病机制具有一定的参考价值。

本研究中表1结果显示：肺癌组织HMGB1、MMP-9及VEGF阳性表达水平均显著高于癌旁组织(P均<0.05)。此结果提示：癌旁组织中由于没有癌细胞激发HMGB1、MMP-9及VEGF的表达，而肺癌细胞能够激发上述因子的阳性表达，因此，肺癌组织中上述因子水平要显著高于癌旁组织中的表达水平。上述结果与林国辉等[10]研究结果相符。本研究中表2结果显示：肺癌组织中有淋巴结转移、腺癌HMGB1、MMP-9及VEGF阳性表达率均分别显著高于无淋巴结转移、鳞癌(P均<0.05)。经分析，出现上述结果可能原因为：肿瘤细胞浸润转移的关键步骤之一是细胞外基质的降解，其中纤溶酶的激活是一个重要环节，MMP-9作为细胞外基质降解酶，能通过促进血管生成和降解细胞外基质，使肿瘤发生浸润、转移[11-12]；HMGB1能够有效诱导细胞凋亡反应过程[13-15]；VEGF能够增强血管内皮细胞有丝分裂的活性水平，VEGF是目前较为明确的淋巴管生成因子，可通过激活淋巴管内皮，刺激淋巴管增生或扩张，这些新生或扩张的淋巴管即为肿瘤细胞的淋巴转移增加了机会[16-17]。本研究结果中表3显示：HMGB1、MMP-9及VEGF，两两之间均呈显著的正相关性(P均<0.01)。此结果说明：(1)肺癌患者机体微环境中存在的HMGBl可能与VEGF在促进肺癌的淋巴结转移方面存在相互作用[18-19]；(2)肿瘤侵袭和转移的机会由于新血管的生成而得到增加。肿瘤内微血管密度(Microvessel density in the tumor，MVD)是用CD34标记肿瘤血管，进行直接观察并量化肿瘤血管生成的方法。进行相关研究发现将MVD可以作为肿瘤血管形成的标志，MVD与肿瘤的复发、转移和预后有关。而有研究表明[20-21]：HMGB-1、VEGF、MMP-9均与MVD呈正相关关系(P均<0.05)，从而进一步证明HMGB-1、VEGF、MMP-9之间呈正相关关系；(3)HMGBl可能通过激活细胞核P13激酶/Akt和NF-kB信号通路从而诱导MMP-9的表达及癌细胞转移。