固相萃取-液质联用测定辣椒粉中苏丹红

周劝娥，王玉，杜小强，刘倩，谭椰子

甘肃平凉市食品检验检测中心（平凉 744000）

近年来，非法添加和滥用合成染料已成为食品安全领域的主要隐患。苏丹红作为一类人工合成的亲脂性偶氮系列化工合成染色剂[1]，由于其色泽鲜艳、着色稳定、价格低廉，常被一些黑心厂家非法添加到辣椒油、辣椒酱和火锅底料等辣椒制品中，以达到长期保持色泽、不易褪色的目的[2]。经食物从口中摄入是苏丹红染料进入机体的主要途径[3]，大量的苏丹红在机体内不断堆积，会对肌体造成不可逆的损伤，更有甚者会引发癌症[4-5]。目前，国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）已将苏丹红I归为三类致癌物；欧盟也发布了辣椒制品里禁止非法添加苏丹红染料的禁令[6]；我国先后发布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单》第一批和第五批[7]也将苏丹红列为禁止在食品中添加的物质。

苏丹红的添加量一般情况下较少，在复杂的食品基质中要准确地检测到极少剂量的苏丹红，对于检测技术的灵敏度、回收率以及重现性等指标都要求颇高[8]。目前，常用于检测苏丹红的方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱法、超高效液相-质谱法、气相色谱-质谱法和凝胶渗透色谱法等[9-14]，其中高效液相色谱法被列入国家标准，但实际操作中该方法存在操作耗时长、流动相复杂、结果重现性差、假阳性（图1）等问题。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苏丹红Ⅰ（99.9%）、苏丹红Ⅱ（99.7%）、苏丹红Ⅲ（94.8%）、苏丹红Ⅳ（99.6%），德国Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、正己烷、甲酸、乙酸乙酯均为色谱纯，德国MERCK公司；试验用水为一级超纯水；试验用辣椒粉为市售。

1.2 仪器与设备

Agilent Infinity II G6460C型超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪（UPLC-MS/MS），美国Agilent公司；MV5型水浴氮吹仪，北京莱伯泰科有限公司；XH-C型旋涡混合器，上海驰唐电子有限公司；SB-80超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；TD5M型多管架自动平衡离心机，上海卢湘仪器有限公司；SQP赛多利斯分析电子天平，赛多利斯（上海）贸易有限公司；SPE-12A固相萃取装置，北京成萌伟业科技有限公司；苏丹红分子印迹固相萃取小柱（500 mg/6 mL），北京中检维康技术有限公司。

图1 标准品的色谱图（A）与光谱图（B）、样品的色谱图（C）与光谱图（D）

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配制

准确量取100 μL的一级标准混合母液（100 μg/mL），用乙腈定容至10 mL，配制成1 μg/mL的二级储备液，放置冰箱备用。

1.3.2 样品溶液的配制

1.3.2.1 提取

准确称取0.5 g辣椒粉于15 mL离心管中，加入5 mL正己烷，在涡旋仪上涡旋混合1 min，超声提取5 min，以3 000 r/min离心5 min，取上清液；重复提取3次，合并上清液，在40 ℃下氮吹浓缩至4 mL，备用。

1.3.2.2 净化

用5 mL正己烷活化苏丹红分子印迹柱，将上述浓缩液加入到小柱中，用5 mL正己烷淋洗，弃去流出液，再用5 mL乙酸乙酯进行洗脱，收集洗脱液，氮吹至进干，用1 mL乙腈定容，涡旋1 min，过0.22 μm滤膜，待测。

1.3.3 色谱条件

色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）柱；流动相A为0.2%甲酸水溶液；流动相B为乙腈；流速为0.2 mL/min，柱温为35 ℃，进样量为2 μL，梯度洗脱。梯度洗脱程序见表1。

表1 UPLC 梯度洗脱程序

1.3.4 质谱参数

离子源，电喷雾电离（ESI+）；扫描方式，多反映监测（MRM）；干燥器温度350 ℃；干燥气流量7 L/min；雾化器压力45 psi；毛细管电压4 000 V。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

选择ESI+电离方式，MRM扫描方式，以50 ng/mL的苏丹红混合标准溶液，分别对碎裂电压及碰撞能量等参数进行优化，主要的优化参数见表2。4种苏丹红的总离子流图见图2。

表2 保留时间及串联质谱参数

图2 混合标准品总离子流图

2.2 标准曲线和线性范围

取一定量制备好的二级储备液，配制成一系列不同浓度的苏丹红混合标准溶液，进样量为2 μL，在上述色谱质谱条件下绘制工作曲线，分别得到苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号的线性回归方程，结果如表3所示。

2.3 液相条件的优化

由于苏丹红分子结构中含有偶氮基团，在水相流动相中加入甲酸可防止色谱峰拖尾并提高电离效率。分别考察不同体积分子的甲酸（0.1%，0.15%和0.2%）对色谱图的峰形和分离度的影响，结果发现，当甲酸添加量为0.2%时峰形较好，故选用乙腈-水（0.2%甲酸）溶液为流动相体系。

从图3可以看出，4种物质完全得到分离，而且分析时间较短。苏丹红Ⅰ～Ⅳ的保留时间分别为1.654，2.478，3.034和2.174 min。结合图2可知，1和6号小峰分别为Ⅲ和Ⅳ号的同分异构体，由于每个离子对的检测通道不同，所以同分异构体的存在不影响各物质的外标法定量分析。

表3 苏丹红的线性回归方程、线性范围和相关系数

图3 苏丹红Ⅰ～Ⅳ子离子扫描质谱图

2.4 检出限、回收率及精密度

根据国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）对检出限的定义，将低浓度的混合标准品添加到阴性辣椒粉中，每个水平平行测定6次，计算各目标化合物峰面积的标准偏差，以3倍标准差计算各个化合物的检出限（置信水平p=95%），选取检出限最低的化合物所对应的结果作为方法的检出限[15]。当4种苏丹红标准品的质量与阴性辣椒粉的质量比为5 μg/kg时，在仪器上有响应，且信噪比S/N＞3，因此确定5 μg/kg为该方法的检出限。

在选定的上述液相和质谱的最佳条件下，以辣椒面为样品基底，考察不同加标浓度下的回收率，平行测定3次，结果见表4。在10，50和100 μg/kg 3个添加水平下，辣椒粉样品中4种物质的回收率在86.5%～102.2%之间，平行样品间δRSD为1.5%～6.0%，可以满足日常分析要求。

表4 4种苏丹红不同加标水平下回收率测定结果

3 结论

此次试验建立了分子印迹固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法检测辣椒粉中4种苏丹红染料的方法。在该方法下4种苏丹红染料在4.5 min内即可实现快速分离检测；当质量浓度为1～50 ng/mL时，4种化合物线性相关良好且相关系数均在0.999 0以上；当加标浓度为10，50和100 μ g/kg时，其平均回收率在86.5%～102.2%之间，且相对标准偏差均小于6%，满足4种苏丹红同时检测的需要。该方法与GB/T 19681—2005的高效液相色谱法相比，大大减少了有机溶剂的用量，缩短了试验时间，在一定程度上有效弥补了国标法重复性差、易出现假阳性的不足。该方法简单快速、经济可靠、灵敏度高、环境友好，适用于辣椒粉中苏丹红的定性定量分析。