致猪腹泻的冠状病毒病的研究进展

李仕林，王雅雯，姜水兵，郭良帅，努尔麦麦提·麦麦提敏，王新新，焦海宏

（塔里木大学动物科学学院新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔843300）

冠状病毒属套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus），该属包括多种动物冠状病毒和人冠状病毒。根据病毒抗原，大部分文献将已知并定型的冠状病毒分为3群[1]：第1群包括人冠状病毒229E（HCoV-229E）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、犬冠状病毒（CCoV）和猫传染性支气管炎病毒（FCoV）；第2群包括人冠状病毒OC43（HCoV-OC43）、牛冠状病毒（BCoV）、火鸡冠状病毒（TCoV）、鼠肝炎病毒（MHV）、猪血凝性脑脊髓炎病毒（HEV）和大鼠冠状病毒（RtCoV）；第3群包括禽传染性支气管炎病（IBV）和火鸡蓝冠病病毒（TCoV）。部分冠状病毒对人有致病性。其中，严重急性呼吸综合征病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）、新型冠状病毒（2019-nCoV）造成的危害较严重。

冠状病毒颗粒有包膜，直径为60～200 nm，呈球形或椭圆形，具有多形性特点。冠状病毒基因组为正链单股RNA，是RNA病毒中最大的病毒，长度约为27～32 kb[2]。基因组有一个5'帽子结构和一个3'PolyA结构。冠状病毒基因组被包裹在螺旋衣壳内，外膜呈球状，表面有许多放射状排列的纤突。包膜表面主要有刺突糖蛋白（S蛋白）、包膜糖蛋白（E蛋白）、膜糖蛋白（M蛋白），还有一些血凝素糖蛋白（HE蛋白）。冠状病毒通过空气以及接触传播，主要感染机体上皮细胞，引起的临床症状主要以呼吸道、消化道等为主。其宿主有猪、牛、猫、犬、老鼠、蝙蝠以及人类等多种哺乳动物和鸟类，被感染的动物，可通过排泄物、污染物和呼吸道传播病毒，其他生物媒介一般不传播该病毒。病毒对乙醚、氯仿和酒精等消毒剂敏感，低温下稳定，60℃加热1 h可灭活病毒，不耐酸不耐碱。该病毒可致猪呼吸道、胃肠道以及神经系统感染。现已知致猪腹泻的冠状病毒病有猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪急性腹泻综合征症。

1 猪流行性腹泻

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhoea，PED）是一种能引起猪胃肠道感染的疾病，以腹泻、呕吐、脱水为主症状。1978年，首次分离出猪流行性腹泻病毒。该病传遍整个欧洲，将其命名为“EVD”。1976年，出现一种可以致哺乳仔猪出现急性腹泻的疾病，将该病称为“EVDII型”。直到20世纪80年代，研究证实上述2类型的流行性病毒性腹泻的病原体相同，都是冠状病毒。随后，被统一命名为猪流行性腹泻（PED）[3]，本病对哺乳仔猪危害较为严重。

1.1 病原

PEDV属于1群冠状病毒，其抗原性与其他冠状病毒无交叉，仅有1种血清型。辅助蛋白ORF3的基因位于S蛋白和E蛋白之间，属PEDV特异性基因。对PEDV分离需用绿猴肾传代细胞培养，鸭肠道细胞也可以用于PEDV的传代培养。PEDV与红细胞不发生凝集现象。

1.2 流行病学

PED只限于猪。病猪和带毒猪是主要传染源，主要经口、粪便、水源、饲料、器具、车辆、工作人员制服以及蚊虫老鼠等传播。该病毒传播迅速、寒冷季节发病频繁、哺乳仔猪发病率和病死率较高。带毒的猪场如有仔猪出生，病毒会不断感染失去母源抗体保护的断奶仔猪，使本病呈地方流行性。

1.3 临床症状及病理变化

哺乳仔猪粪便不成型，以黄色、淡绿色或灰白色为特点、且恶臭、不带血，死亡率较高。保育猪和成年猪症状较轻，后期可自行恢复。剖解可见肠系膜淋巴结肿大、肠内有黄色液体和干酪样乳块。组织学观察，空肠上皮细胞有空泡形成、肠绒毛变短、细胞变性坏死。

1.4 诊断方法

对小肠组织接种于绿猴肾传代细胞（Vero）加入胰酶进行盲传分离[4]。为检测血清中PEDV特异性抗体，以PEDV的N蛋白为抗原建立FMIA方法，以免疫血清为抗体、PED致敏红细胞为抗原建立的间接凝集试验（IHA）和以病毒阳性标本为抗原、被检血清为抗体、以兔抗猪lgG荧光抗体建立的间接免疫试验（IFA）对猪传染性胃肠炎进行检测[5]。根据GenBank中已发表的猪流行性腹泻病毒疫苗株ORF3基因序列，设计并合成特异性引物[6]，建立检测猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株的RT-PCR方法。根据GenBank PEDV M基因、TGEV S基因、PoRV VP7基因的保守序列设计特异性引物[7]，建立RT-PCR方法。以猪流行性病毒腹泻N基因序列，设计特异性引物[8]，建立RTPCR方法。对GenBank中多株PEDV M基因序列进行比对后，设计特异性引物[9]，建立荧光定量PCR方法。

1.5 防治措施

采用猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和轮状病毒细胞培养物制备三联灭活疫苗[10]。中国农科院哈尔滨兽医研究所制备猪传染性胃肠炎（TGE）和猪流行性腹泻（PED）二联灭活苗及二联活疫苗[11]。用2.5%恩诺沙星注射液进行肌肉注射，按每10 kg体重1 mL的量进行注射，每天2次；还可用头孢噻呋钠+链霉素+黄芪混合进行肌肉注射，每天2次，连用2～3 d，治疗效果明显[12]。给母猪饲喂表达PEDV S蛋白的重组枯草芽孢杆菌，可有效提高母猪乳汁及其分离细胞特异性SlgA、lNF-γ、TGF-α的水平[13]。以白头翁汤为基础方剂，添加柯子、苍术、厚朴对猪流行性腹泻治疗，获得良好的疗效[14]。根据猪流行性腹泻的流行病学特点，可对带毒猪和病猪进行隔离，对粪便、水源、饲料、器具、车辆、工作人员制服严格消毒，定期驱蚊杀鼠，用以上措施减少病毒的传播。冬春季节做好仔猪保温工作，确保仔猪吃到初乳，增加机体免疫力。无病期间对疑似病进行及时检测，对疫区及受威胁区进行严格管控。

2 猪传染性胃肠炎

猪传染性胃肠炎（transmissible gastroenteritis，TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种胃肠道疾病。该病常与PED混合感染，预防本病难度较大，给养猪业造成严重的危害。1933年，美国首次报道该病，现阶段该病已在世界各国流行[15]。

2.1 病原

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）属于冠状病毒属1群冠状病毒，TGEV可在猪肾细胞或猪甲状腺细胞上生长[16]。TGEV与猪呼吸道冠状病毒（PRCV）有交叉保护作用，病毒可凝集牛、鸡和豚鼠的红细胞，不凝集人、小鼠和鹅的红细胞，且病毒只有一种血清型。

2.2 流行病学

TGE经粪便、乳汁、呕吐物及鼻分泌物等传播，经感染TGE死亡猪的血液和屠宰废弃物易可传播。2周龄哺乳仔猪发病较多、死亡率高、潜伏期短。该病爆发于寒冷季节，常与PED混合感染。新疫区呈流行性，老疫区则呈地方流行性。猪是该病的自然宿主，贮存宿主有犬、猫、小鼠、仓鼠、兔、狐狸等，都可携带病毒[17]。

2.3 临床症状及病理变化

腹泻是猪传染性胃肠炎的主要特征。哺乳仔猪粪便颜色呈黄绿色或灰白色，粪便中有凝乳块。TGE临床症状与PED极为相似。哺乳仔猪发病出现急性死亡，死亡率高。5周龄以上的仔猪死亡率较低，后期可自愈。剖解可见小肠肿胀、出血、肠壁透明松弛、肠系膜淋巴结肿大。镜检可见肠绒毛缩短脱落、内膜粗糙。

2.4 诊断方法

目前，实验室以ST、PK15和IBRS2细胞系用来分离TGEV。利用原代猪甲状腺细胞进行TGEV分离，盲传九代出现具有典型TGEN细胞病变效应（CPE），再适应猪肾传代细胞IBRS-2获得成功。

以重组的N蛋白作为诊断抗原，建立TGEV抗体间接ELISA检测方法；以TGEV N蛋白作为诊断抗原，建立检测TGEV血清抗体的间接ELISA检测方法；以抗TGEV N蛋白的单抗和多抗血清建立双抗体夹心ELISA方法；在单克隆抗体基础上建立免疫组化法[18-19]。根据猪流行性腹泻和传染性胃肠炎的基因序列通过设计2对特异性引物，建立双重RT-PCR检测方法[20]。现代分子生物学技术发展克服诸多难题，新的检测方法不断被应用，如恒温隔热RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR等用于病原的检测，但在实际工作中需要与其他检测方法配合应用[20-21]。

2.5 防治措施

对妊娠母猪和哺乳仔猪进行猪传染性胃肠炎猪和流行性腹泻弱毒二联苗免疫，可有效保护出生仔猪、断奶仔猪和育肥猪抵抗TGEV和PEDV强毒的攻击[22]。用乌洛托品腹腔注能有效提高病猪的康复率[23]。TGE免疫以局部黏膜免疫为主[24]，免疫妊娠母猪后，哺乳仔猪可从乳汁中获得免疫保护。近些年，有研究学者用复方中药对TGE进行治疗研究。用高剂量郁金散加减方（郁金散的基础上添加白术、甘草、木香、白头翁4味中药，同时减去黄芩、黄檗、栀子、大黄）对TGE有较好的治疗效果，用黄芪提取液和香菇提取液与枯草芽孢杆菌、食淀粉乳杆菌、屎肠球菌3种益生菌的培养上清联合使用发现其抗TGEV作用明显[25-26]，其中，枯草芽孢杆菌联合黄芪提取液效果较好。

根据该病流行特点，对猪场犬、狐狸、老鼠进行扑杀，冬春季节应加强哺乳仔猪圈舍温度；同时，做好定时通风，对圈舍及内部设备定期消毒。在TGE易感季节对环境和人员流动加强管制、做好定期检疫记录、制定完整的免疫计划。当发病时，隔离病猪、封锁疫区、紧急免疫、对病死猪进行无害化处理、对圈舍彻底清洗消毒，平时要加强饲养管理。

3 猪急性腹泻综合征

猪急性腹泻综合征（SADS）由一种新型蝙蝠冠状病毒（SADS-CoV）引起。本病发病率高、死亡率高、5日龄内仔猪多发。仔猪出现急性腹泻、呕吐。

3.1 病原

2017年，在华南某猪场从腹泻仔猪体内成功分离出病毒。研究证实，是1种类似蝙蝠冠状病毒HKU2的冠状病毒SADS-CoV[27]，属于1群冠状病毒，具有典型冠状病毒结构，SADS-CoV对仔猪的致病力低于PEDV。PEDV、TDEV、PDCoV（猪德尔塔冠状病毒）的抗体与SADS-CoV不发生交叉反应。

3.2 流行病学

该病主要经呼吸道、消化道传播，被污染的饲料、工具、运输车也可传播。病猪和带毒猪是该病的主要传染源.5日龄以下仔猪发病率达90%，8日龄以上仔猪死亡率较低，病程2～5 d。该病冬春季节多发。

3.3 临床症状及病理变化

哺乳期仔猪以呕吐、水样腹泻、病程短为主要特征。母猪出现轻微腹泻，后期可恢复健康。剖解可见小肠肿胀、肠壁变薄、肠管弹性降低等。组织学检查，肠上皮细胞变性坏死、肠绒毛缩短。

3.4 诊断方法

根据新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的保守序列核衣壳蛋白（N蛋白）基因设计特异性荧光定量PCR引物和探针[28]，建立一种检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光定量引物及试剂盒。根据GenBank数据库中SADS-CoV GDS04毒株的核衣壳蛋白（N）基因核酸序列设计特异性套式引物[29]，建立检测SADS-CoV的套式PCR方法。

3.5 防治措施

现阶段，尚无疫苗预防本病，抗生素治疗效果无效。用中药藿香、大腹皮、厚朴、茯苓、陈皮、谷芽、苍术、萹蓄组成方剂，对腹泻猪进行治疗，取得较好效果；用水杨梅全草水煎灌服治疗腹泻猪，治疗效果明显[30]。根据该病的流行特点，冬春季节加强哺乳产房的保温工作，保证饲料质量。本病的发生与PED感染有密切关系，要加强对PED愈后观察。对发病或死亡猪进行无害化处理，对人员、工具、场地、圈舍严格彻底消毒。

4 展望

近年来，猪冠状病毒病在国内外广泛流行，其血清型较多，易发生变异，并且冠状病毒引起动物临床症状各不相同。现阶段，由于冠状病毒易发生变异，需进一步分离病毒株，开发不同型号的疫苗。