不同检测系统血肾素和醛固酮结果一致性及对临床诊断的影响分析*

杜超，牛长春，田华，李甜，李智杰，廖璞,

(1.重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育部重点实验室，重庆400016;2.重庆市人民医院检验科 重庆市临床检验中心，重庆400014)

根据《中国心血管病报告2018》[1]，我国心血管疾病处于持续上升阶段，推算目前患者2.9亿人，其中高血压占2.7亿人。高血压可防可控，研究表明，降压治疗可降低脑卒中风险35%～40%，降低心肌梗死风险20%～30%，降低心力衰竭风险超过50%[2]。因此，高血压早期的准确诊断并及时采取干预措施对于降低高血压的并发症及致死率有重要意义。在高血压的早期诊断中，肾素(renin)、醛固酮(aldosterone)等已成为原发性和继发性高血压分型诊断、治疗及研究的重要指标[3]。其中在继发性高血压应用中，尤其是在原发性醛固酮增多症(primary aldosteronism，PA)筛查中，血浆肾素和醛固酮测定及其相关比值计算是关键的筛查依据[4-5]。目前肾素及醛固酮的检测方法有放射免疫法(radioimmunoassay，RIA)、化学发光免疫法(chemiluminescent immunoassay，CLIA)、液相色谱串联质谱法(liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)。其中,CLIA应用最为广泛，其可能原因是：与RIA相比，测定价值相当，甚至更优，并且具有快速、安全(无放射性)的程序和易于重复检测的优势[6-7]。CLIA包括国外和国内品牌，其中国外品牌以意大利索灵为代表，国产品牌以郑州安图、深圳新产业及深圳迈瑞等为代表。而随着CLIA广泛应用于临床诊疗活动，关于不同化学发光检测系统间的结果比较则报道较少，因此本研究借助重庆市临床检验中心平台优势，旨在研究不同化学发光检测系统血肾素及醛固酮浓度结果一致性及对临床诊断的影响。

1 材料和方法

1.1标本来源 收集2019年8月体检健康成年人(男、女各60例)EDTA-K2抗凝血浆标本120份，标本采集时间为上午8∶00—11∶00，充分离心后保存于-80 ℃，待检。体检健康者纳入标准：年龄≥18岁；BMI(体质指数)≤35 kg/m2；血压<140/90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)；肝功能、肾功能、血糖、血脂等生化指标正常，心、肝、脾、肾超声检测大致正常(无严重病变)；内科常规检查无异常：肺部呼吸音清晰，心音、心界、心律正常，肝、肾、脾触诊正常，无腹部包块及压痛，神经系统未见异常。

1.2调查样品制备 收集患者经检测后剩余EDTA-K2抗凝新鲜血浆标本，保存于-80 ℃,待用。肾素和醛固酮调查样品分别制备，分2批检测，编号为S1～S5(低、中、高值各1、2、2个)和S6～S10(低、中、高值各2、2、1个)。调查样品制备过程：室温解冻患者标本，直接混合或将高低浓度标本混合制备成不同浓度的调查样品，去除杂质后分装，每个样品均0.4 mL(最大检测用量0.355 mL)，以冷链(干冰)配送至各实验室待检。调查样品的均匀性、稳定性经GB/T 28043—2011附录B方法检验，符合要求。

1.3调查样品检测方案 CLIA检测系统包括进口A系统和国产B、C及D系统(以下简称A、B、C、D)，其系统及试剂均相配套，检测项目为直接肾素浓度(direct rennin concentration，DRC)和血浆醛固酮浓度(plasma aldosterone concentration，PAC)。关于DRC，A与C单位为μIU/mL，B单位为pg/mL，pg/mL与μIU/mL在D系统中均有使用，二者间换算公式为1 pg/mL=1.67 μIU/mL(源自其试剂说明书)；关于PAC，单位均为pg/mL。本研究纳入39家实验室参与调查，室温解冻后检测样品(检测1次)。由于LC-MS/MS检测醛固酮灵敏度、特异性及重复性俱佳[6-9]，被推荐为检测醛固酮的“金标准”，因此，进一步采用LC-MS/MS检测S6～S10醛固酮浓度。LC-MS/MS分析：采用Phenomenex Kinetex C18(50 mm×4.6 mm，2.6 μm)色谱柱进行色谱分离，流动相为0.2%甲酸水和0.2%甲酸甲醇，梯度洗脱；采用三重四极杆质谱仪AB Triple Quad 5500电喷雾电离源负离子模式，多反应监测模式，醛固酮及d7-醛固酮内标离子对分别为359.2/331.2和366.2/338.3，校准品源自Cerilliant(LOT NO.FN02281704)，单位换算：1 pg/mL=0.1 ng/dL=2.77 pmol/L[5]。

1.4调查样品数据处理 结果按试剂不同分组，分组数据按Dixon检验法剔除离群值后计算均值，实验室间变异系数(CV)及各样品的实验室间CV平均值，其中均值结果用于不同化学发光系统间一致性分析。S6～S10醛固酮结果再与LC-MS/MS进行一致性分析。

1.5健康成人标本检测 健康成年人标本经A与D系统检测，其检测结果用于进一步验证A与D系统间一致性。A系统配套肾素检测试剂盒(批号：304001A)和醛固酮检测试剂盒(批号：134603A)；D系统配套肾素检测试剂盒(批号：2019020100)和醛固酮试剂(批号：2018120100)。检测系统不精密度分为批内和批间，肾素项目A系统分别为2.52%～4.87%和7.01%～13.03%，D系统分别为0%～6%和0%～10%；醛固酮项目A系统分别为2.1%～4.2%和5.8%～10.5%，D系统分别为0%～8%和0%～10%。

1.6统计学分析 采用MedCalc19.1.3对数据进行分析。分析不同化学发光系统间检测结果的一致性，采用Passing-Bablok回归计算斜率、截距及95%置信区间(confidence interval,CI)，采用Bland-Altman图分析平均绝对偏差与相对偏差，采用Pearson相关分析相关性。采用Wilcoxon符号秩检验和Mann-WhitneyU检验比较不同分组的健康成年人的检测结果。非正态分布数据以M(P25，P75)表示，用P2.5～P97.5表示参考区间。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同检测系统间DRC结果一致性分析 见图1和表1。在参与实验室中，检测S1～S5的实验室数量为A=4、B=10、C=2、D=1，检测S6～S10的实验室数量为A=4、B=10、C=3、D=18。为便于D系统参与统计分析，按公式换算为μIU/mL和pg/mL。A、C、D以及B、D系统间Passing-Bablok回归显示，Y≠X，图1显示A-D和B-D线性回归较为接近，Y=X，但B-D间斜率95%CI不包括1。相关性系数(r)为0.901～0.992(P<0.01)。Bland-Altman分析显示A-D系统间平均偏差较小。实验室间CV分别为A(1.85%～16.91%，平均7.38%)、B(6.81%～31.60%，平均15.14%)、C(1.57%～22.61%，平均9.10%)、D(5.54%～8.94%，平均7.44%)，其中在低浓度值样品中，A、B、D系统CV值较其他浓度值样品偏高，而C系统绝大多数样品结果高于A及D系统。B系统结果通过与D系统比较，推测可能与A系统结果偏差较小，而偏低于C系统结果。

注：A、B、C、D分别为A-C、A-D、D-C、B-D之间的Passing-Bablok回归及相关性分析，黑色实线为Passing-Bablok回归线，两侧黑色虚线为95%CI线，红色虚线为Y=X线；r为相关系数。D系统单位换算公式为1 pg/mL=1.67 μIU/mL(源自试剂说明书)。

表1 不同检测系统间DRC一致性分析结果

2.2不同化学发光系统间PAC结果一致性分析 见图2和表2。在参与实验室中，检测S1～S5的实验室数量为A=4、B=10、C=7、D=1；检测S6～S10的实验室数量为A=4、B=10、C=7、D=18，其中B系统的S5样品检出1个离群值。A、B、C及D系统间Passing-Bablok回归显示Y均不直接等于X，图1显示A-D和B-C线性回归较为接近Y=X。不同化学发光系统间r为0.944～0.976(P<0.01)。Bland-Altman分析显示A-D系统间平均偏差最小。各系统实验室间CV分别为：A(1.98%～11.3%，平均6.66%)、B(11.65%～25.62%，平均17.58%)、C(5.80%～28.32%，平均12.98%)、D(5.16%～8.77%，平均6.61%)。

注：A、B、C、D、E、F分别为A-B、A-C、A-D、B-C、B-D、C-D之间Passing-Bablok回归及相关性分析，黑色实线为Passing-Bablok回归线，两侧黑色虚线为95%CI线，红色虚线为Y=X线。

表2 不同检测系统间PAC一致性分析结果

2.3PAC结果与LC-MS/MS一致性分析 表3显示，在Passing-Bablok回归分析中，Y≠X。在相关性分析中，LC-MS/MS与不同检测系统PAC结果不具相关性。在Bland-Altman分析中，各系统PAC结果与LC-MS/MS均呈负偏差且偏差较大。

表3 LC-MS/MS与不同检测系统PAC结果的一致性分析

2.4A和D系统健康成年人DRC和PAC比较分析 A及D系统检测健康成年人结果的DRC、PAC和ARR中位值均不一致，差异有统计学意义(P<0.05)；不同性别间DRC差异无统计学意义(P>0.05)，而PAC和ARR差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 A、D系统健康成年人结果[M(P25，P75)]

DRC和PAC A、D系统间r分别为0.962和0.944(P<0.01)，DRC和PAC A、D系统的Passing-Bablok回归分析结果显示，Y=0.989(95%CI:0.397～1.436)+1.157(95%CI:1.109～1.206)×X，Y=-19.91(95%CI:-27.3244～-13.3446)+1.052(95%CI:0.982～1.123)×X，见图3，其中，Y为D系统检测结果，X为A系统检测结果。

注：A、C为A与D系统健康成年人Passing-Bablok回归分析；黑色实线为Passing-Bablok回归线，两侧黑色虚线为95%CI，红色虚线为Y=X。B、D分别为A与D系统健康成年人的Bland-Altman分析比对绝对偏差图，中间黑色实线为平均绝对偏差，上下黑色虚线为±1.96s，红色虚线为0线,其中95%的点均在±1.96s线内。

DRC、PAC立位结果呈偏态分布，以P2.5～P97.5建立参考区间：A系统分别为1.95～68.27 μIU/mL和28.55～313.75 pg/mL；D系统分别为3.53～94.82 μIU/mL和14.5～311.05 pg/mL。

3 讨论

本研究结果显示A与D系统间一致性和相关性均较好，但健康成年人DRC结果两系统间却存在恒定差异。以P2.5～P97.5建立DRC和PAC立位参考区间，A系统为1.95～68.27 μIU/mL和28.55～313.75 pg/mL，D系统为3.53～94.82 μIU/mL和14.5～311.05 pg/mL。

目前，DRC和PAC是原发性和继发性高血压的分型诊断、治疗及研究的重要指标[3]。尤其是在PA的诊疗活动中，指南推荐醛固酮/肾素比值(aldosterone to rennin ration，ARR)作为筛查指标，在PA确诊试验中以PAC结果为确诊依据之一[4-5]。尽管指南也建议实验室应建立适合自己的相关诊断切点，但通过我们调查发现大多实验室乐意接受指南或共识所推荐切点，而通过结果分析可以推测同一患者在使用同一诊断切点的情况下，经不同检测系统检测可能得出截然不同的诊断结果。

4个系统DRC均采用捕获抗体加检测抗体的双位点检测活性肾素(包括活性肾素和开放构象肾素原)[10]，因而特异性抗体识别位点的差异可能导致C系统结果偏高及各系统间一致性差异。醛固酮分子量小且结构简单，PAC采用竞争法检测，存在与醛固酮3C葡萄糖苷酸(醛固酮代谢产物)及其他类固醇物质发生交叉反应的可能[7]。LC-MS/MS仅检测纯醛固酮，不与其他物质反应，相较于化学发光法，具有更高的灵敏度、特异性及重复性[6-9]，被推荐为检测醛固酮的“金标准”。在与LC-MS/MS进一步比较中，其结果均高于LC-MS/MS结果(与Yin等[8]研究结果相一致)，其偏差大小与PAC一致性分析中结果相似(A-D、B-C间一致性及相关性较好)。总之，不同检测系统间的结果准确性及一致性亟待提高。

A与D系统间相关性和一致性均相对较好，而对健康成年人检测结果进一步验证分析中，显示仅PAC结果一致性较好，而DRC结果却存在一定的恒定误差，建立参考区间也有所差异，且与杨秀勇等[11]使用类似检测系统(纳入143名健康成人，其中男48名、女9名5)建立的参考区间也不完全一致(DRC和PAC在A与D系统中分别为：2.4～90.0 μIU/mL和30.8～344.6 pg/mL、3.6～98.3 μIU/mL和29.4～473.3 pg/mL)。其原因可能是实验室间CV，尤其是低浓度值样品的CV相对更高，且该研究中男女比例不一致可能会影响参考区间的建立。在高血压人群中，20%～30%表现为肾素和醛固酮均降低，6%～10%表现为肾素降低而醛固酮升高[12]，因此短期内不同检测系统间一致性不能改善的情况下，目前各实验室建立一个合理的参考区间对于这部分人群的疾病诊断及监测十分有必要，而通过检测技术的不断提高进而实现标准化和一致化，建立统一的参考区间。

本研究不足之处，如部分检测系统结果的分组数较少，可能会导致结果有所偏差。健康成人纳入人群的人口情况(如未检测K离子浓度等)未充分调查，以排除隐藏的患病人群，可能造成参考区间有偏差。