环介导等温扩增技术在下呼吸道感染常见病原体检测中的应用*

顾锦，郭会，周围，吴玉敏，毛易捷，孙靖，马锦洪，王玉月，史伟峰

(苏州大学附属第三医院检验科，江苏常州 213003)

据世界卫生组织发布的最新统计结果显示, 2016年下呼吸道感染造成全世界300万人死亡，其导致的严重疾病已经成为全球关注的公共卫生问题[1]。传统的细菌培养和细菌学检验技术不能及时准确地为临床提供诊断结果，这是造成下呼吸道感染疾病致死率居高不下的主要原因之一。因此，建立一种高效、敏感、快速、准确的病原学检测方法, 对临床早期诊断和精准治疗有着至关重要的作用。环介导等温扩增技术(loop-mediated thermostatic amplification, LAMP)针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，利用链置换DNA聚合酶在恒温(65 ℃)条件下反应[2]，用荧光染料掺入法进行实时荧光检测，扩增阳性的样品可产生类似实时荧光的“S”形扩增曲线，一步完成对靶基因的扩增和检测。同时将LAMP法与微流体芯片技术相结合，可同时对多种病原体核酸靶序列进行高通量并行检测[3]。该技术不需要经过模板的高温变性和低温退火过程，在1 h内即可完成检测，大大缩短了检测周期[4]。本研究使用传统培养法加基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)鉴定和LAMP法对148例下呼吸道感染患者标本同时检测，LAMP法检出的肺炎支原体标本再采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time RT-PCR，RT-qPCR)法复检，而结核分枝杆菌复合群检出后使用二代测序(next-generation sequencing technology，NGS)技术验证，以期为临床提供更为快速可靠的实验室诊断依据。

1 材料和方法

1.1一般资料 选取2018年6月到2019年10月在苏州大学附属第三医院呼吸内科就诊的下呼吸道感染患者合格的痰标本103例，男性78例，女性25例，年龄(65.7±17.0)岁。其中，慢性阻塞性肺疾病急性加重患者16例，支气管扩张急性加重患者7例，慢性支气管炎急性发作患者10例。选择同期儿科患者45例，年龄0～12岁，留取肺泡灌洗液标本45份。

1.2仪器和试剂 恒温金属浴(杭州奥盛科技公司)，恒温混匀仪(杭州瑞成仪器公司)，MALDI-TOF MS仪(德国布鲁克公司)，RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪、H-1微型混合器(上海康禾光电仪器公司)，呼吸道病原体核酸检测试剂盒(微流控芯片、阳性对照品、恒温扩增试剂)(北京博奥生物公司)，ABI 7500扩增仪(美国应用生物系统公司)。肺炎支原体核酸定量检测试剂盒(PCR荧光探针法，中山大学达安基因公司)，MGISEQ-2000基因测序仪(深圳华大智造公司)。

1.3标本采集及处理 使用无菌有盖容器取痰液或纤支镜灌洗液，肉眼观察痰液性状后取少量涂片，染色镜下观察上皮细胞和白细胞数量，根据观察结果初步判断感染情况。

1.4MALDI-TOF MS细菌鉴定 用无菌拭子挑取标本涂布接种于血平板和巧克力平板上培养72 h后观察结果，严格按照《全国临床检验操作规程》进行操作。挑取每份临床标本常规细菌培养后可疑的单个菌落再次分纯培养。将分纯后的菌株在MALDI-TOF MS细菌鉴定仪上检测，以Bruker Biotyper系统线性正性模式采集相对分子质量2 000～20 000的蛋白质指纹图谱，与标准数据库进行比对，得出匹配分值用以判断结果。匹配分值>2.0为鉴定到菌种水平，结果高度可信；分值1.7～2.0为鉴定到菌属水平，结果可信；分值<1.7为鉴定结果不可信。本研究以1.7分为界值，未达1.7分视为未检出。

1.5LAMP试验

1.5.1标本处理及核酸提取 痰标本、肺泡灌洗液中加入等体积10%NaOH，置于漩涡振荡器上使标本尽可能振散，然后37 ℃液化30 min，黏稠度高的标本可适当增加NaOH量或延长液化时间，液化后的痰标本以没有黏稠感为宜。取1 mL液化后的痰标本或肺泡灌洗液至1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心5 min，弃上清液；向离心管中加入1 mL洗液，涡旋振荡，12 000 r/min离心5 min，弃上清液；加入100 μL核酸提取液，用移液器吹吸沉淀，将液体和沉淀一起转移至核酸提取管中，将核酸提取管置于微型混合器中，最大振速振荡至少5 min；将核酸提取管置于95 ℃金属浴中，加热至少5 min。然后10 000 r/min离心1～3 min，取上清液核酸留作恒温扩增和RT-qPCR。

1.5.2恒温扩增反应及结果判断 将20 μL恒温扩增反应液和35 μL核酸提取液加入200 μL离心管中，混匀后加至呼吸道病原体核酸检测芯片中，将芯片置于离心机6 000 r/min离心1 min后上RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪扩增。结果定性标准：45 min内扩增曲线明显出峰，且半定量结果≥1×103，即判定阳性；标本细菌浓度<1×103或没有明显扩增曲线，判定为阴性。

1.6RT-qPCR 选取45例儿科患者肺泡灌洗液标本，用肺炎支原体核酸定量检测试剂盒(PCR荧光探针法)进行检测。取肺炎支原体RT-PCR反应液40 μL、Taq酶3 μL、1.5.1处理后的样本核酸2 μL以及阴性、弱阳性、强阳性质控品各2 μL，混合成45 μL体系进行扩增。按照增长曲线及Ct值进行结果判读：如果增长曲线不呈S型或Ct值=30，判定为阴性；如果增长曲线呈S曲线，且Ct值<30则判定为阳性。

1.7高通量测序 选择2份LAMP检测后结核分枝杆菌复合群阳性的痰标本，委托深圳华大基因公司进行高通量测序。取0.5～3 mL痰标本，经玻璃珠混合震荡后按照TIANamp Micro DNA Kit(DP316,天根公司)试剂盒说明书提取DNA。提取后的DNA超声破碎至150 bp大小的片段。核酸片段经过末端修复、接头连接、无偏向性PCR放大信号后完成建库。使用Agilent 2100 Bioanalyzer质控文库插入片段(大小200～300 bp)，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher公司)质控DNA文库浓度(不低于1 ng/μL)。质量合格的文库序列经环化形成单链环形结构。环化后的文库经滚环复制生成DNA纳米球。制备好的DNA纳米球加载到测序芯片，使用MGISEQ-2000基因测序仪进行测序。测序数据下机后去除低质量的和长度小于35 bp的数据以获得高质量的数据。通过BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比对将高质量数据中比对上人参考基因组序列的数据去除。剩下的数据在去除低复杂度reads后与专用的微生物大数据库比对，并将比对后的数据按照病毒、细菌、真菌和寄生虫等进行分类和排列。专用的微生物大数据库包括筛选自NCBI数据库(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)的与人类疾病相关的4 061个病毒基因组、2 473个细菌基因组、199个真菌基因组和135 个寄生虫基因组。

1.8统计学分析 用SPSS 17.0 统计软件进行。计数资料以率或构成比表示，配对计数资料比较采用Fisher精确概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1细菌分离培养及质谱鉴定 148例标本中经常规培养后，MALDI-TOF MS鉴定的总检出率为42.6%(63/148)，共分离出81株病原菌。63例阳性标本中，有44例检出单一致病菌(29.7%)，19例检出复合病原菌，其中13例检出2种病原菌(8.78%)，5例检出3种病原菌(3.3%)，1例检出4种病原菌(0.68%)。

2.2LAMP检测结果 LAMP以细菌拷贝数1×103为界值，148例标本判定为阳性结果的有101例，检出率为68.2%，共检测出175种病原体。45例肺泡灌洗液中共检出肺炎支原体26株(57.8%)。101例阳性标本中，55例(37.2%)为单一病原菌，46例为复合病原菌(31.1%)，其中合并2种病原菌有32例(21.6%)，合并3种病原菌有7例(4.7%)，合并4种病原菌仅3例(2.7%),合并5种病原菌2例(1.3%)，合并6种病原菌1例(0.6%)，合并7种病原体1例(0.6%),见图1。

注：a，大肠埃希菌；b，肺炎支原体；c，鲍曼不动杆菌；d，阳性外对照；e，流感嗜血杆菌；f，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；g，阳性对照；h，铜绿假单胞菌；i，金黄色葡萄球菌。

2.3LAMP技术与质谱法检测细菌的比较 当在同一份标本中2种方法检出至少一种相同的细菌，就判为2种结果相符(双阳性)，否则认为不符。148份标本中，2种方法检测到至少同一种细菌有42例(双阳性)，2种方法均未检测到细菌39例(双阴性)，LAMP阳性而痰培养质谱鉴定阴性或检测出完全不同的病原体59例，质谱法阳性而LAMP阴性8例。2种检测方法对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌的检出率差异无统计意义(P>0.05)，而LAMP法对肺炎链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌以及肺炎支原体的检出率高于培养法(P<0.05)，见表1。

表1 148例患者行LAMP法检测下呼吸道病原体感染情况

2.4RT-qPCR及NGS检测结果 148例样本中，LAMP法检出肺炎支原体26例，RT-qPCR法检出23例，两者一致率达88.5%。见图2A。另外，148例样本中LAMP法检出结核分枝杆菌复合群2例，抗酸染色均未找到分枝杆菌，见图2B。将2例样本外送NGS测序，分析证实为结核分枝杆菌复合群阳性。样本(18S4001600)下机总序列数为38034682条，总数据量约1.9 G，检出结核分枝杆菌序列数440条，基因组覆盖率为0.494%(21 929/4 439 387)，相对丰度为18.96%。样本(19S0031462)下机总序列数为23 636 361条，总数据量约为1.2 G，检出结核分枝杆菌序列数2条，基因组覆盖率为0.002 3%(100/4 439 387)，相对丰度为4.44%。

注：A，a，阳性外对照；b，阳性内对照；c，肺炎支原体；B，a，阳性外对照；b，阳性内对照；c，结核分枝杆菌复合群。

3 讨论

人体的上呼吸道常有定居细菌群，下呼吸道分泌物经上呼吸道排出时通常受到正常菌群的污染[5]，故本研究检出的呼吸道定植菌需要结合临床表现判断是否存在由该细菌引起的感染。下呼吸道感染包括急慢性支气管炎、肺炎、支气管扩张等疾病，主要由细菌、支原体、衣原体、嗜肺军团菌、病毒等微生物感染引起，常由上呼吸道感染向下蔓延，其反复发作会继发多器官感染[6]。临床上供选择的抗菌药物日益增多，耐药菌株亦明显增多，大剂量头孢菌素的应用更导致院内感染愈加严重。早期诊断可以指导下呼吸道感染的治疗选择针对病原体的有效抗菌药物。呼吸道标本常规的细菌检验路径为首先肉眼观察和涂片检查标本是否合格，将标本接种于血平板、巧克力平板、麦康凯平板培养基，真菌检查接种于沙氏培养基，结核分枝杆菌检查则接种于罗-琴培养基或米氏7H10培养基，于35 ℃培养18～24 h观察菌落形态和涂片染色镜检，然后进行质谱鉴定和药敏试验。肺炎支原体培养因营养要求高，生长缓慢，需观察10～30 d或更长时间，对临床诊断帮助不大，因此抗原/抗体或核酸检测更为广泛[7]。

148例疑似下呼吸道感染患者的肺泡灌洗液和痰样本使用LAMP检测，结果表明LAMP十三联检较传统培养法病原体检出率高，因为LAMP法敏感性和特异性较高，能从微量拷贝中扩增出所需的目的基因，其检测下限为6个拷贝。LAMP法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌阳性由mecA基因指示，结果显示从103例痰标本中检测出24例耐甲氧西林葡萄球菌，而常规培养法未检出。在常规培养中，葡萄球菌的药敏检测方法主要有纸片扩散法和肉汤稀释法，具有检测速度快、操作简便、价格低廉、可直观反应检测结果等优势，但是在前期分离培养过程中常常因为其菌落较其他细菌菌落小而被覆盖，容易造成漏检，而且菌落表达情况各不相同，导致纸片扩散法检测存在一定误差。

肺炎支原体是呼吸道感染中的常见病原体[8]，也是社区获得性肺炎的主要病因。肺炎支原体由于缺乏细胞壁而对常见的β-内酰胺类抗菌药物不敏感[9]，早期诊断肺炎支原体感染可以减少这类抗菌药物的不必要使用。本文采用LAMP法从45例肺泡灌洗液中检出26例肺炎支原体，而使用RT-qPCR法则检出23例，两者一致率为88.5%。RT-qPCR对肺炎支原体的检测具有高灵敏度和快速性，仅需2～3 h即可获得结果，但是由于其昂贵的成本和复杂的处理程序以及对专业水平的要求高而无法在基层地区常规推广，尤其是在基层实验室。因此，LAMP可以快速简便地检测肺炎支原体，有效改善其诊断速度和治疗，并减少对抗菌药物的滥用，且其敏感度并不亚于RT-qPCR法。

由于结核分枝杆菌生长缓慢，难分离培养出菌落，容易耽误患者诊疗。本文采用LAMP技术检测出2例结核分枝杆菌复合群，用高通量测序证实为结核分枝杆菌复合群，提示LAMP法可快速诊断出结核分枝杆菌复合群，比常规培养法敏感性高，且成本较低高通量测序更低。

综上所述，呼吸道病原体核酸恒温扩增芯片十三联检较传统细菌培养检测，具有高效、快速、敏感、简单及覆盖面广的优点，可为临床诊治提供快捷可靠的实验室依据，对临床早期诊断和精准治疗具有重要作用。