毛发分析在法庭科学中的应用进展

何昕宇， 王燕燕， 王继芬*

(1.中国人民公安大学侦查学院，北京 100038;2.法庭毒物分析公安部重点实验室，北京市公安局司法鉴定中心，北京 100192)

1 前言

在法庭科学中，常会根据医学或法律调查中的法律规定对滥用药物进行常规分析，从而为相关案件提供信息[1,2]。毛发分析在法庭科学中的应用潜力很大，这在很大程度上是因为与常规的生物医学检测方法相比，毛发分析有以下几个优点:(1)药物和代谢物随着毛发生长进入发干中，随着时间的推移慢慢积累，提供了一个相对较长的检测窗口期，其检测范围比血清或尿液的检测范围要宽(数周至数月)，而血清或尿液中的药物水平会在较短的时间内(数小时至数天)迅速降低;(2)毛发收集简单且无创，这让毛发分析结果的造假可能性变低;(3)在处理样品时，几乎没有生物安全风险(即疾病传播);(4)毛发样本非常稳定，可以在室温下无限期保存，以便将来在需要时轻松确认初始结果[3]。

尽管如此，毛发样本仍存在一些缺点，主要是由于其基质的生物学复杂性[4,5]。毛发分析中最重要的两个问题是样品制备和药物固定的药代动力学[6]。由于基质的复杂性，毛发样本的制备需要进行繁琐的步骤。关于药代动力学，所用药物剂量与毛发中药物浓度之间的相关性尚存争议，法医科学家对数据解释存有疑问，从而阻碍了毛发分析在相关领域的普遍应用。除了这两个缺点以外，个人毛发生物学的多样性和黑色素的量都会对毛发分析产生不同程度的影响[7,8]。鉴于此，本文主要从法庭科学应用的角度，对毛发中药物沉积、提取、分析和一些相关应用进行了总结和讨论。

2 毛发生理学

毛发是一种丝状结构，主要由角蛋白构成，角蛋白是一种高度疏水的卷曲螺旋结构化的α-螺旋蛋白。它由蛋白质(65%～95%)、脂质(1%～9%)和色素(0.1%～5%)以及少量的微量元素、多糖和水组成。毛发的生长是周期性的，在生长期和静止期之间交替，通常约85%的毛发处于生长期。毛发生长速度取决于毛发的类型、生理因素和生长位置。

图1 药物掺入毛发的示意图Fig.1 Schematic diagram of drug incorporation into the hair shaft

随着相关研究人员对毛发生理学的深入研究，毛发分析在法庭科学中的应用范围也越来越广泛。在毛发生理学中影响毛发分析的主要因素是毛发的颜色和药物固定的药代动力学。Polettini等[8]在相关研究中发现毛发中滥用药物的检测结果随着毛发颜色的不同受到一定程度的影响。多年来，为了弄清药物进入毛发的机理，已经进行了数项研究。Musshoff等[9]对毛发生理学中药物固定的药代动力学进行了大量实验研究，但是相关研究结论还是无法系统解释药物掺入毛发的机理。简单的被动转移是解释药物在毛发中沉积的最简单模型，根据该模型，药物通过发根中生长细胞的被动扩散而掺入到毛发中，并且当发生角化作用时，药物以紧密结合的形式转移至发干。如果毛发的生长速度恒定，则药物在毛发中的沉积取决于血液中药物的浓度。复杂的多室模型是描述毛发中药物沉积机理的另一种模型，这种模型比前一种模型应用范围更广。外源物质至少可以通过三种机制进入毛发[10]，如图1所示：来自毛囊中毛发形成过程中的血液、来自汗液和皮脂中的物质转移、来自外部环境。尽管上述模型的组合可能是解释药物掺入头发机制的最现实模型，但其它途径或模型的相对重要性尚不明确，因此不能忽略。

3 毛发分析概述

毛发分析的基础是样品制备。而样品制备是影响实验结果好坏的最重要因素，但是目前还没有一种可以确保毛发样本中所有类别物质都有最佳提取效率的通用样品制备程序[21]。大多数相关实验一般建议采用简单的甲醇萃取方法，因为它几乎可以与所有滥用药物兼容并且不会引起分析物水解。毛发分析需要较长的过程，一般包括以下几个步骤[11]：(1)取样；(2)毛发样本分段；(3)清洗毛发样本以消除任何可能的外部污染；(4)球磨粉碎或切割成小片；(5)提取药物，包括毛发基质中原体及其代谢物；(6)毛发提取物的净化和目标化合物的预浓缩；(7)不同分离分析技术对药物的测定。毛发测试协会(Society of Hair Testing,SOHT)和欧洲工作场所药物测试协会(European Workplace Drug Testing Society,EWDTS)已发布了毛发中的药物测试指南，这些指南被视为主要参考，并且近些年来未作任何修订[12,13]。

表1列出了SOHT推荐的阈值浓度[12]和基于各个实验室经验的滥用药物的预期浓度。而且对于许多药物，尚未确定阈值，包括新精神活性物质(New Psychoactive Substances，NPS)、γ-羟基丁酸(Gamma-hydroxybutyrate,GHB)、合成代谢类固醇药物、苯二氮卓类药物等。

表1 SOHT推荐的毛发中滥用药物检测阈值浓度(用色谱法分析时)和预期浓度

在法庭科学相关研究中，毛发分析大部分应用色-质联用技术或酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)测定。许多实验室经常使用ELISA技术来检测毛发中的待测物，但这需要对毛发进行去污，然后将样本粉碎并在甲醇中孵育，随后挥干溶剂并在萃取物中加入缓冲溶液，最后按照生产商的方法(与尿液和血液相同)进行ELISA快速筛查检测。近年来，报道了一些新技术用于毛发中药物的分析检测，如实时直接分析-高分辨率质谱法[14,15]、手性分离[16]或毛发质谱成像[17]等技术。但目前大多数实验室主要使用液相色谱-串联质谱法(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC/MS-MS)进行检测。

4 应用

4.1 对药物史的验证

通过提供相关一段时间内接触药物的信息，毛发分析可用于验证自我报告的吸毒史。在对照研究期间，吸毒者无法掩盖自己的药物滥用情况，因为毛发分析的窗口期通常很长。毛发分析提供个人药物使用情况时，需要进行分段分析，包括将一根头发切成小段，以测量药物在对应时间段内的使用情况。

毛发分析对吸毒史的验证普遍涉及法庭科学中的各个领域，毛发分段分析被用来验证吸毒者以前的吸毒史和最近强制戒毒的情况。为了验证其戒断有效期，可以在距毛发根部最近位置的分段部分检测其药物含量。基于吸毒史的毛发分析对于确定非自然死亡时间的应用非常广泛。Kuwayama等[18]使用利多卡因作为内部时间标记物(Internal Temporal Marker,ITM)对从尸体提取的头发进行分析，在发束的特定区域检测到利多卡因，再根据发根到发束中利多卡因峰出现的距离，以及平均头发生长速度来估计死亡时间。与传统的解剖学检查不同，使用毛发的新颖估计方法使检测人员更加准确的估计死亡时间范围。Montagna等[19]采用灵敏的气相色谱-串联质谱同时测定头发中的鸦片，可卡因及其代谢物，以评估驾驶执照申请人过去接触相关滥用药物的情况。María等[20]建立了一种超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)方法，用于分析分段头发中的16种合成阿片类药物,首次报道了在真实头发样品中获得了满足阈值浓度的戊芬太尼和四氢呋喃芬太尼，确定了芬太尼使用者药物史的信息，这可以帮助其他实验室解释其结果。

毛发分析可以用来验证同一人的药物消耗的相对变化。许多研究表明，如果一个人服用双倍剂量的药物，这大致相当于双倍毛发药物含量，但血液和尿液中的药物水平并不总是如此。在相同的条件下，影响毛发药物分析的一个主要因素是毛发的颜色(或黑色素含量)，不同类型的头发含有不同数量的药物[21,22]。此外，还有一些相关影响因素(如个体差异)还需要进一步研究。

4.2 验证使用兴奋剂

运动员使用内源性或外源性合成类固醇来改善体重和力量，缩短两次锻炼之间的恢复时间。毛发分析被用来调查尿液或血液出现假阴性结果的可能性，特别是在比赛前更频繁使用违禁物质的情况下。此外，对毛发的分段分析可以提供关于可能重复用药的历史和频率的信息[23]。解释毛发中的睾酮浓度可能具有挑战性，因为睾酮的生理浓度与滥用者身体中发现的相当,关键在于确定检测到的物质是否来自内源性睾酮的睾酮酯[24]。毛发分析的另一个优点是可以区分去雄酮和其它19-去甲甾体(去雄烯二醇和去雄烯二酮)滥用，母体化合物只能在毛发中检测到，而在尿液基质中不能检测到[25]。因此，在对运动员进行历史调查时，毛发分析可以成为证明使用兴奋剂的解决方案[26]。

虽然沙丁胺醇被允许使用，而且必须在比赛前申报，但很容易逃脱尿液阳性测试(尿液浓度低于阈值水平)，因为该药物具有特定的治疗效果，并且拥有医疗处方。而毛发分析将明确证明运动员服用过兴奋剂，当药物(如合成代谢化合物或皮质激素)在许多连续的毛发部分被发现时，毛发分析可以说是尿液分析的有效的辅助验证手段。使用尿液进行药物检测有三个主要缺点[27]：假阳性、观察到的尿液收集质量下降以及难以捉摸的操作，包括掺假。

科学文献中没有太多涉及毛发中合成类固醇鉴定的文章，因为只进行了几项研究。氯睾酮是一种合成的合成代谢雄激素类固醇，具有增加肌肉块头和力量的作用。近些年来，含有氯睾酮的药物在运动员中被滥用。先前的研究表明，如果单次摄入禁用物质，包括无意地服用类固醇，尿液可能会导致阳性反应。在这种情况下，通过证明替代性给药或相关实验，毛发分析可有助于进一步验证。Alberto等[28]建立了UPLC-MS/MS法检测头发中的氯睾酮和醋酸氯睾酮，并采取一些因使用氯睾酮而受到制裁的运动员的毛发样品进行检测，以跟踪与兴奋剂相关的实验研究，并根据检测出的成分来判断氯睾酮摄入的来源。氢氯噻嗪作为利尿药和抗高血压药，虽然其本身不具备兴奋性，但用此类药物可极大加快和促进尿液排泄，可以被用来稀释尿液中的违禁药，因此在一些体育活动中氢氯噻嗪等利尿剂也是必备的检测项目。Gheddar等[29]通过采用UPLC-MS/MS法检测毛发中的氢氯噻嗪，结果在运动员头发中检出了36 pg/mg的氢氯噻嗪。由于在头发中无法检测到单次接触氢氯噻嗪，并且根据患者的日常治疗结果，运动员头发中发现的氢氯噻嗪与反复接触相对应，因此无法确定剂量和频率。但是在一些特定兴奋剂的案例中，毛发分析可以作为补充手段，为其检测结果提供佐证。

在很多违禁药物检测中，毛发分析也发现了其它提高比赛成绩的药物，如β-肾上腺素能药物(激动剂和拮抗剂)[30]、麻黄素[31]和皮质类固醇[32]。虽然毛发还不是国际奥委会或世界反兴奋剂机构(World Anti-Doping Agency,WADA)的有效样本，但世界上大多数法院都是认可的。目前的一个关键问题是出现了一些相互矛盾的检测结果：在经认证的世界反兴奋剂机构实验室的尿液检测呈阳性的运动员，而在经认证的法医实验室的毛发分析中为阴性。但是如果毛发分析中检测结果为阴性的话，就可以确定运动员之前的尿液检测为假阳性。因此，毛发分析在验证使用兴奋剂的相关应用可以作为保证尿液检验结果的客观公正性。

4.3 毒品犯罪

毒品犯罪是当今社会上非常普遍的现象[33]，例如麻醉药(如GHB、氯胺酮)、苯二氮卓类药物(如劳拉西泮、氟硝西泮)、其它催眠药(如唑吡坦、佐匹克隆)、镇静剂(如一些镇静抗组胺药)、滥用药物(如摇头丸、大麻)等。毒品犯罪的受害者一般不能准确回忆起当时的情况，因为这些物质大多使受害人具有健忘性(如苯二氮卓类药物)。此外，由于这些物质的作用时间一般较短(只会持续几个小时)，并很快从体内排出，因此几乎不可能在血液或尿样中检测到，而毛发分析可以提供受害者以前接触过的证据。

在毛发分析时MS/MS可以检测单剂量的镇静剂[34,35]，在犯罪发生后8 h及以上收集生物样本时，毛发分析是检测受害人暴露于GHB的唯一方式[36,37]。在几个案例中，药物是在连续的片段中发现的，因此检测毛发中单一药物的基本要素是在与所称事件的时期相对应的片段中是否存在相关化合物。很多专家建议在事件发生的4～5周后再采集一缕头发样本，假设头发生长速度正常(1厘米/月)，将头发分成三段，每段2厘米，以记录可能的暴露。单次给药将通过在近端2厘米节段(根部)存在药物来确认，而在其它两个节段则没有检测到。

由于受药物的影响，毒品促成的性侵犯(Drug-Facilitated Sexual Addault,DFSA)案件通常报告较晚。因为受到“迷奸药”的影响，受害者变得无法理解发生了什么，也记不起任何与事件有关的事情，当她意识到这一情况时，要从尿液或血液中检测使用的药物已经为时已晚[38]。Islam等[39]对一名44岁男子在聚会后被袭击的案例进行分析，由于报告犯罪的时间较晚，15 d后对头发(黑色)进行了采样，并进行了分段分析，以寻找大多数DFSA物质和NPS。每段20 mg(A：0～1 cm，B：1～3 cm，C：3～5 cm)，在pH为5.0的磷酸盐缓冲液中孵育,样品用碱液萃取，经Hypersil Gold PFP色谱柱分离后，采用TSQ Vantage质谱仪，电喷雾电离正离子模式，MRM采集。近端检出4-甲基乙基卡西酮、亚甲基二氧基吡咯戊酮和多巴胺，浓度较低(分别为3.5、9 pg/mg)，与上个月单次接触所称事实符合。在B和C段中没有检测到这些物质，表明在据称的事件发生之前没有重复接触这些物质。Alberto等[40]建立了对毛发中31种兴奋剂、苯乙胺类迷幻药等药物的UPLC-MS/MS检测方法，该方法在10～1 000 pg/mg范围内线性关系最佳，相关系数在0.9981～0.9997之间。4-甲氧基苯环利啶(4-MeO-PCP)的定量限为1.8 pg/mg，6-(2-氨基丙基)苯并呋喃(6-APB)的定量限为35 pg/mg，该研究证实了具有增强刺激活性的新型设计药物在多重滥用消费者的目标人群中的传播日益增加。还有一些实验成功地使用了ITM微段毛发分析技术来确定药物摄入的具体日期[41]。Kuwayama等[42]通过液相色谱-高分辨率质谱(LC-HRMS)进行的药物筛选显示，在从毛发提取物获得的色谱图中存在唑吡坦衍生物的特定峰。使用ITM进行微细分分析，采用灵敏的LC-MS/MS估计唑吡坦的摄取天数。受害者以21 d为一个周期，分两次将感冒药作为ITM摄入，以计算头发的实际增长率。第二次ITM摄取2周后再次收集她的发束，以0.4 mm的间隔切割发束，并绘制唑吡坦和ITM在发束中的分布曲线，结果估计服用唑吡坦的日期与她所报告事件的发生日期一致。结合LC-HRMS进行药物筛选和使用LC-MS/MS进行微细分分析确定药物摄入的日期，有助于阐明研究毒品犯罪中药物与事件之间的关系。

毒品犯罪也涉及其它不同的药物，例如氯胺酮、催眠药和GHB。用于DFSA的药物被转化为代谢物，因此在尿液或血液中检测不到它们的存在。DFSA受害者的头发样本可以在距离报案1个月后进行采样分析,虽然大多数情况下不能检测到母体化合物，但可以检测到代谢物[43]。

4.4 其它相关应用

毛发分析在法庭科学中的应用除了上述介绍的以外，还有妊娠期药物暴露的测定[44]、入职前和驾照体能测试的药物筛查[45]、死因鉴定[46]、金属毒性测定[47]、酗酒检验[48]、儿童头发中的药物检测[49]等应用。

5 结论和展望

近年来，毛发已成为一种常用的生物检材，是血液和尿液等常规检材的替代品。然而，由于毛发基质的复杂性再加上药物浓度含量通常很小，因此需要开发更高选择性和灵敏性的分析方法。为了在法庭科学中更好地利用毛发分析，必须对毛发基质的优缺点有透彻的了解。毛发是非常独特的基质，因为与传统的血液和尿液基质相比，随着时间的推移会记录有关使用历史的全面信息。从毛发分析在就业前筛查、法庭科学和临床中越来越多的应用中可以看出，毛发分析在识别受试者中药物暴露方面的优势正在不断得到认可。

对毛发分析结果的最佳解释目前仍然存在争议，特别是在美容治疗、外部污染、种族偏见和药物掺入来源等方面。因此，在此基础上需要进行进一步的研究。在毛发分析研究中，应将重点放在开发更绿色、更有效的头发去污策略上以及研究药物掺入头发的机理(它如何受诸如黑色素含量、年龄和性别等因素影响)，以便能够更可靠地解释结果。此外，使用多种高灵敏度的分析方法可以帮助获得有关分析样品的更准确和详细的信息，从而避免对结果的误解。