高效液相色谱法测定小鼠肝脏中的两种苯并三唑类紫外线吸收剂

朱梅青， 崔 蓉*

(北京大学公共卫生学院，北京 100191)

2-(2′-羟基-3′,5′-二叔丁基苯基)-5-氯苯并三唑(2,4-Di-tert-butyl-6-(5-chloro-2H-benzotriazole-2-yl)phenol，UV-327)、2-(2′-羟基-3′,5′-二叔戊基苯基)-苯并三唑(2-(2H-benzotriazol-2-yl)-4,6-di-tert-pentylphenol，UV-328)均为苯并三唑类紫外线吸收剂，它们能强烈吸收270～380 nm和290～400 nm的紫外光[1]。因化学性质稳定，挥发性小，与聚烯烃相容性好而广泛应用于油漆涂料、合成纤维、毛纺织品、感光材料、食品包装材料和化妆品中。UV-327和UV-328在环境中不易降解、高度亲脂，易在体内蓄积，且具有潜在毒性，已成为备受关注的一类新型环境内分泌干扰物[2]。暴露于特定的职业环境、水环境污染以及食品包装材料的迁移等都有可能使人体接触到此类物质。研究表明，浅水鱼类(鲻鱼、鲈鱼)肝脏中UV-327的浓度比其他部位高3～4倍，与乌鱼肝脏中UV-328的浓度分布一致，表明该类化合物可能优先积累在某些鱼种的肝脏，且降解较少[3]。多项大鼠实验结果表明，UV-327和UV-328对肝脏有明显的毒性作用。每日用掺入UV-328(>200 μg/g)的饲料喂养大鼠90 d，可观察到大鼠的血液、肝脏和肾脏均产生不良影响[4]。以UV-327(22～800 mg/kg/d)喂养大鼠90 d[5]，大鼠肝脏重量呈剂量依赖性增加，出现肝脏毒性症状，且雄性大鼠在25 mg/kg UV-327重复剂量暴露下，其血清中碱性磷酸酶、白蛋白和白/球蛋白比值、绝对肝脏重量和相对肝脏重量均升高[6]。由此可见，肝脏是UV-327和UV-328毒性效应的重要靶器官。

目前，有关UV-327和UV-328测定方法的研究仍多集中于非生物样品的检测，如污水[7]、污泥[8]和塑料食品包装材料[9]等，而生物样品中检测方法的报道较少，且目前尚未见小鼠组织中UV-327和UV-328测定方法的研究报道。本研究建立了小鼠肝脏中UV-327与UV-328的测定方法，可为后续进一步研究其在动物体内的代谢过程、组织中的分布特征以及动态变化规律等提供检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Waters高效液相色谱仪(美国，Waters科技有限公司)，包括Waters 1525 Binary HPLC Pump，Waters 717 plus Autosampler，Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector；MX-S旋涡混合仪(美国，Scilogex公司)；TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器厂)；D -130手持式超细匀浆器(德国，Wiggens公司)。

UV-320(2-(2′-羟基-3′,5′-二叔丁基苯基)-苯并三唑，内标)，纯度98%(上海毕得医药科技有限公司)；UV-327、UV-328，纯度98%(萨恩化学技术(上海)有限公司)；甲醇(纯度≥99.9%)；丙酮；正己烷；生理盐水。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制分别称取10 mg UV-320、UV-327及UV-328，于100 mL容量瓶中用甲醇定容，配制成质量浓度均为100 μg/mL的标准储备液。取一定体积UV-320标准储备液，用甲醇逐级稀释配制质量浓度为0.40 μg/mL的UV-320标准应用液。取一定体积UV-327及UV-328标准储备液，用甲醇逐级稀释，配制质量浓度分别为0.10、0.20、0.40、1.00、2.00、4.00、10.0、20.0、40.0 μg/mL的UV-327和UV-328混合标准系列溶液。

1.2.2 样品采集与预处理小鼠脱臼处死，在冰面上迅速取出肝脏，用生理盐水洗净表面的血液，滤纸吸干后称重。按照0.50 g/mL(小鼠肝脏重量/生理盐水体积)加入生理盐水，涡旋混匀。取100 μL小鼠肝脏匀浆，加入1.0 mL正己烷-丙酮溶液(体积比1∶1)，涡旋混匀3 min，13 560×g离心5 min。将上清液转入干净管中，50 ℃氮气吹干，残渣用200 μL甲醇溶解，涡旋混匀3 min，13 560×g离心5 min，上清液经0.45 μm尼龙过滤器过滤，高效液相色谱-紫外检测器测定。

1.2.3 色谱条件色谱柱：Waters SymmetryC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；保护柱：Waters SymmetryC18柱(20 mm×3.9 mm，5 μm)；流动相：甲醇；流速：1.0 mL/min；紫外检测波长：340 nm；柱温：24 ℃；进样量：10 μL。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1 测定波长的选择依据文献报道[1]可知，UV-320、UV-327和UV-328在紫外-可见波长范围内均有2个吸收峰，其波长分别为303、340 nm(UV-320)，313、345 nm(UV-327)和299、336 nm(UV-328)，且各组分的后一个吸收峰的吸收强度较大，因此，检测波长选择340 nm。

2.1.2 色谱条件的选择本实验分别以甲醇、乙腈、甲醇+水、甲醇+20%乙腈水溶液、乙腈+0.1%甲酸水溶液、95%甲醇-乙腈溶液+水、甲醇+0.1%甲酸作为流动相，考察各组分的分离情况。结果发现，以甲醇为流动相时，基线稳定，各组分分离良好，且肝脏内源性物质不干扰组分和内标的测定。因此，本实验最终确定以甲醇为流动相，流速1.0 mL/min。

2.1.3 样品前处理方法的选择既往文献报道中，测定生物样品中UV-327和UV-328含量时，通常采用超声法[4]、索氏提取法[2]或萃取法[10]提取目标物，萃取液经凝胶渗透色谱法去除脂质，硅胶柱层析法去除非极性杂质等，操作步骤繁杂，耗时较长。常用的萃取剂为甲醇、乙腈、正己烷、丙酮、甲苯、氯仿以及二氯甲烷/乙醚或其混合溶液[11]。本实验对比了甲醇、乙腈、正己烷、丙酮、正己烷-丙酮作为提取剂的实验结果，发现以1.0 mL正己烷-丙酮混合液(体积比1∶1)作为萃取液，UV-327和UV-328的萃取效率较高，萃取效果好，且方法简便快速。

2.2 特异性

在上述已确定的色谱条件下，考察内源性物质对目标物质测定的影响。如图1所示，UV-327、UV-328与内标UV-320的色谱峰峰形良好，可完全分离，且肝脏中内源性物质对UV-327、UV-328与内标UV-320的测定无干扰。

图1 小鼠肝中UV-320、UV-327和UV-328的高效液相色谱图Fig.1 Chromatograms of UV-320,UV-327 and UV-328 in mice livera.blank liver;b.blank liver spiked with UV-320(0.20μg/mL);c.blank liver spiked with UV-320(0.20 μg/mL) and UV-327(2.00 μg/mL);d.blank liver spiked with UV-320(0.20 μg/mL) and UV-328(2.00 μg/mL);e.blank liver spiked with UV-320(0.20 μg/mL),UV-327(2.00 μg/mL) and UV-328(2.00 μg/mL).

2.3 工作曲线的线性范围、检出限与定量限

取空白小鼠肝脏匀浆100 μL，分别加入0.40 μg/mL UV-320溶液100 μL，不同浓度UV-327和UV-328混合标准溶液100 μL，按照“1.2.2”所述方法处理样品。以UV-327或UV-328的质量浓度为横坐标，UV-327或UV-328与UV-320的峰面积比值为纵坐标，绘制工作曲线。分别以3倍和10倍噪声水平对应的UV-327或UV-328的浓度确定方法的检出限和定量限。结果显示，在实验选定的色谱条件下，在0.05～20.0 μg/mL浓度范围内，UV-327或UV-328与内标UV-320(0.20 μg/mL)的峰面积比值呈现良好的线性关系，回归方程分别为：y=4.6242x-0.011，r=0.9999；y=4.2498x-0.3582，r=0.9998。UV-327和UV-328的检出限均为0.01 μg/mL，定量限均为0.03 μg/mL。

2.4 准确度与精密度

取空白小鼠肝脏匀浆100 μL，加入0.40 μg/mL UV-320溶液，以及一定浓度的 UV-327和UV-328混合标准溶液各100 μL，制备低、中、高(0.20、2.00、16.0 μg/mL)3种加标浓度的质控样品，每种浓度做6个平行样，连续测定3 d，考察方法的准确度和精密度。3种加标浓度的质控样品中UV-327和UV-328的平均回收率分别为97.2%、94.9%、98.5%与102.2%、97.0%、99.1%；日内精密度分别为5.6%、4.9%、3.7%与5.3%、4.5%、3.8%；日间精密度分别为8.2%、7.8%、2.8%与9.5%、6.7%、2.8%。空白小鼠肝脏中未检出UV-327、UV-328和UV-320。结果表明，本方法的准确度和精密度良好。

2.5 提取回收率与基质效应

如“2.4”所述，制备低、中、高3种加标浓度(0.20、2.00、16.0 μg/mL)的质控样品，按照“1.2.2”所述方法处理，每种浓度做6个平行样，测得的UV-327或UV-328与UV-320的峰面积比记为A。另取空白小鼠肝脏匀浆100 μL，加入1.0 mL正己烷-丙酮(体积比1∶1)，涡旋混匀3 min，13 560×g离心5 min，氮气吹干后，加入0.40 μg/mL UV-320溶液和一定浓度的 UV-327和UV-328混合标准溶液各100 μL，使加标样品中UV-327和UV-328最终质量浓度分别为0.20、2.00、16.0 μg/mL，每种浓度做6个平行样，测得的UV-327或UV-328与UV-320的峰面积比记为B。计算提取回收率(E%)=A/B×100。用甲醇分别配制质量浓度为0.20、2.00、16.0 μg/mL的UV-327和UV-328混合标准溶液,每种质量浓度做6个平行样，测定其与UV-320(0.20 μg/mL)的峰面积比记为C，计算基质效应(ME%)=B/C×100。3种加标浓度的质控样品中UV-327和UV-328的提取回收率分别为97.6%、98.9%、94.2%与97.8%、95.3%、94.3%；基质效应分别为110.8%、99.2%、92.5%与112.3%、100.7%、92.3%。结果表明，本方法的提取回收率高，样品的基质效应对测量结果的影响较小。

2.6 稳定性

如“2.4”所述，制备低、中、高3种加标浓度(0.20、2.00、16.0 μg/mL)的质控样品，每种浓度取6个平行样，考察室温下放置6 h及-40 ℃下保存15 d条件下，样品中UV-327和UV-328的稳定性。3种加标浓度的质控样品室温下放置6 h，UV-327和UV-328测定值的相对偏差分别为5.0%、1.5%、1.0%与5.0%、1.5%、0.1%；-40 ℃放置15 d，UV-327和UV-328测定值的相对偏差分别为10%、4.0%、1.3%与10%、1.5%、0.9%。结果表明，小鼠肝脏样品室温下至少可以放置6 h，-40 ℃冰箱中可以保存15 d。

2.7 实际样品测定

对小鼠单次灌胃分别给予UV-327或UV-328，采用上述建立的高效液相色谱法测定其肝脏中UV-327或UV-328的含量。图2a和图2b分别为灌胃4 h小鼠肝脏中UV-327、UV-328测定的色谱图。如图所示，UV-327或UV-328与内标UV-320可完全分离，峰形良好。灌胃4 h，小鼠肝脏中UV-327、UV-328的平均浓度(n=5)分别为10.4 μg/mL和8.43 μg/mL。

图2 实际样品测定的色谱图Fig.2 Chromatograms of real samplesa.chromatogram of UV-327 after 4 h gavage in mice liver;b.chromatogram of UV-328 after 4 h gavage in mice liver.

3 结论

本文以小鼠肝脏为样品，建立了小鼠肝中UV-327和UV-328的高效液相色谱测定方法，方法的准确度、精密度和灵敏度均可满足实际样品中UV-327和UV-328含量的测定要求，且样品预处理方法简便快速，使用的有机试剂毒性相对较低、量少，对环境的污染小，方法具有一定的实际应用价值。