突触结合蛋白2基因多态性与中国汉族精神分裂症的关联研究

阳 红，黄欣欣，刘 超，梁青松，杨 华，张建标，徐 健，王颖怡，吴海苏，吕钦谕#，易正辉

1.湖南省怀化市第四人民医院临床心理科，怀化418000；2.上海交通大学医学院附属精神卫生中心临床六科，上海201108；3.江苏省南通市第四人民医院精神二科，南通226000

精神分裂症是一组常见的病因未明的重性精神疾病，病程多迁延，全球患病率约为1%［1］，约有一半的患者最终发展为精神残疾，给社会、家庭以及患者本人带来了沉重的负担。精神分裂症的临床症状错综复杂，患者一般无智能与意识障碍，主要以阳性症状、阴性症状、认知功能损害三大核心症状以及情感症状等其他症状为主要表现。目前的研究［2］认为，精神分裂症是一种神经发育障碍的大脑疾病，大脑内的神经发育障碍导致了脑内的微小病理变化；同时，遗传因素、生物因素和环境因素的相互作用在精神分裂症的发病过程中起到了重要的作用。

近年来，关于精神分裂症的神经突触假说越来越受到广大学者的关注。神经递质在调节和保持正常的精神活动方面起着十分重要的作用，精神分裂症的发生可能与神经递质的释放改变有关［3］。可溶性N-乙基马来酰胺敏感因子附着蛋白受体（soluble NSF accessory protein receptor，SNARE）蛋白复合体及其相互作用蛋白对于囊泡的募集、对接、膜融合起着关键的作用，这种囊泡运输机制的异常可能通过触发异常的神经胞吐而参与精神分裂症的发生［4-5］。突触结合蛋白（synaptotagmin，SYT） 作为与SNARE蛋白复合体相互作用的蛋白之一，与SNARE蛋白复合体形成的复合物为膜融合的基本分子构件［6］。SYT是囊泡膜融合的Ca2+感受器蛋白，与SNARE 复合体相互作用，对于囊泡膜和质膜的融合起到了重要的调节作用，并间接影响神经递质的释放，主要对认知和学习记忆产生影响［7-8］。目前发现的SYT 亚型一共有17种［9］，可分为6大类；其中SYT1 和SYT2 是突触囊泡膜蛋白的主要组成部分，两者具有类似的作用，主要调节囊泡的快速胞吐过程［10］。目前已有研究［11］证实SNARE 复合体与多种精神疾病有关，如精神分裂症、双相情感障碍、注意缺陷多动障碍（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD），孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）等。作为与SNARE复合体存在相互作用关系的SYT，有研究［12］发现痴呆患者的认知功能损害与SYT2的显著缺失有关；且有报道［13］显示，SYT2 基因突变与儿童ADHD 的发生有关，而与成人ADHD无关，考虑可能出现这一矛盾结果的原因与不同年龄阶段神经发育程度的不同有关。SYT2基因主要影响神经递质的释放，对于脑部尾核和前脑区域的突触传递尤为重要；该基因突变会导致突触传递的异常，进而可能会导致突触结构和功能发生改变［14］。这种脑区功能的改变可能对精神分裂症患者的认知功能产生影响，因此SYT2 基因可作为精神分裂症的候选基因。目前，尚未有SYT2基因多态性与精神分裂症的相关报道。基于此，为进一步明确SYT2 基因多态性与精神分裂症的关系，本研究选 取SYT2 基 因 的rs6427957、 rs907697、 rs12564274、rs10800856 和rs61820945 共5 个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点进行检测，通过病例对照的关联分析探讨SYT2 基因多态性与中国汉族人群精神分裂症发生的关联性。

1 对象与方法

1.1 研究对象及分组

1.1.1 病例组 本研究共纳入精神分裂症患者478 例（SZ 组），来源于2015 年9 月—2018 年9 月在湖南省怀化市第四人民医院及上海交通大学医学院附属精神卫生中心的住院或门诊患者。入组标准：①符合《精神疾病诊断与统计手册（第5 版）》［Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders （Fifth Edition），DSM-5］关于精神分裂症的诊断标准。②年龄＜75岁。③汉族。排除标准：①具有明显的自杀、自残及危害他人风险。②有严重的躯体疾病。③存在物质及药物滥用。

1.1.2 对照组 通过广告招募474 位社区志愿者为正常对照者（HC 组）。入组标准：①年龄＜75 岁。②汉族。③健康者与患者无血缘关系。排除标准：①有精神疾病及精神疾病家族史。②有严重的躯体疾病。③处于妊娠期或哺乳期。

研究得到了上海交通大学医学院附属精神卫生中心伦理委员会的批准（批件号：2017-19R）。所有研究对象及其监护人在入组前均签署了知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 一般人口学资料的收集 收集研究对象的一般人口学资料，主要包括年龄、性别、民族等。

1.2.2 SNP 位点的选择 SYT2 基因数据从千人基因组数据库（http：//grch37.ensembl.org/index.html）中查询并下载，使用HaploView 软件以及SNP 在线网站（http：//gvs.gs.washington.edu/GVS150/）筛选标签SNP（tag SNP），针 对SYT2 基 因（NC_000001.11， chr1： 202590596～202710454）及基因上游2 000 bp，以连锁不平衡系数（r2）＞0.8、微小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）＞0.05的原则进行挑选。

1.2.3 DNA 提取 抽取SZ 组及HC 组人群外周静脉血5 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，采用血液基因组DNA 提取试剂盒（上海莱枫生物科技有限公司）提取全血DNA，并于-80 ℃冰箱中冷冻保存。

1.2.4 基因型检测 应用TaqMan 探针基因分型技术对rs6427957、rs907697、rs12564274、rs10800856、rs61820945位点的SNP 进行检测。TaqMan SNP Genotyping Assays 试剂盒和TaqMan SNP Genotyping Mix 试剂盒采购自美国ABI 公 司。PCR 扩 增用7900 HT 荧 光实 时 定量PCR 仪（ABI 公司，美国）。PCR 扩增反应体系为5 μL，包括2×Taqman Master Mix 试剂2.0 μL、40×Taqman Genotyping Assay 试 剂0.05 μL、DNA （15～20 ng/μL） 2 μL、H2O 0.95 μL。PCR 反应条件：95 ℃10 min 预变性；95 ℃15 s，60 ℃1 min，共进行50个循环，每例样本均重复检测3次。采用Sequence Detector Software version 2.1（SDS version 2.1）软件中Allelic Discrimination 程序进行基因分型，通过检测不同等位基因FAM（6-carboxy-fluorescein）和VIC（4,7,2'-trichloro-7'-phenyl-6-carboxyfluorescein）荧光强度来判断样本的基因型，并将结果保存。

1.3 统计学分析

使用SPSS 23.0 软件对SZ 组和HC 组的一般人口学统计资料进行比较。定量资料用x±s表示，采用独立样本t检验进行分析；定性资料用n（%）表示，采用χ2检验进行分析。应用SHEsis在线软件（http：//analysis.bio-x.cn/SHEsis Main.htm）进行哈迪-温伯格（Hardy-Weinberg，H-W）平衡检验、单个位点的关联分析（等位基因、基因型频率的比较）及位点之间的单倍型分析。采用SNPstats在线软件（https：//www.snpstats.net/snpstats/start.htm）对不同位点的遗传模式进行分析。使用Haploview 统计软件进行两两位点之间的连锁不平衡分析（linkage disequilibrium，LD），用D'值来度量各个位点间的连锁不平衡程度。关联分析结果采用Bonferroni进行校正检验，即每个SNP 的P 值乘以所分析的遗传标记数目，若校正后的P值仍小于0.05认为位点与疾病之间的关联为有显著性。样本的统计效能应用Quanto 1.2.4 软件进行计算。所用统计学检验均为双侧检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般人口学资料

SZ 组共计478 例，其中男性251 例（52.5%）、女性227 例（47.5%）；年龄13～74 岁，平 均年 龄（41.73±20.06）岁。HC组共计474例，其中男性249例（52.5%）、女性225 例（47.5%）；年龄17～64 岁，平均年龄（36.17±13.08）岁。通过比较该2 组的一般人口学资料发现，平均年龄（t=5.062，P=0.000）间差异具有统计学意义，而性别（χ2=0.000，P=0.995）间差异无统计学意义。

2.2 SNP位点的选择结果

共挑选出5个标签SNP，即rs6427957［chr1：202593299（GRCh38.p12）］、rs907697［chr1：202599607（GRCh38.p12）］、rs12564274［chr1：202710717（GRCh38.p12）］、rs10800856［chr1：202710926（GRCh38.p12）］、rs61820945［chr1：202712006（GRCh38.p12）］。其中，rs12564274和rs10800856 位于启动子区域，rs907697 位于内含子区域，rs6427957位于3'端非翻译区，rs61820945位于转录因子结合区域。

2.3 H-W平衡检验

5 个 位 点 （rs6427957、 rs907697、 rs12564274、rs10800856、rs61820945）在HC 组中均符合H-W 平衡，可以被纳入后续的分析。

2.4 样本量计算

应用Quanto 1.2.4 软件进行计算，将计算条件设置为：MAF=0.2，OR=1.5，加性模式，疾病一般人群患病率为1%，统计效能为80%。结果显示共需SZ 组269 例、HC组269名。

2.5 统计效能检验

5 个SNP 中rs61820945 的MAF 最小，为0.214。应用Quanto 1.2.4 软件对统计效能进行计算，设置条件为：MAF=0.214，OR=1.5，加性模式，疾病一般人群患病率为1%，SZ组478例、HC组474名，计算结果显示统计效能为0.97。

2.6 SYT2基因5个位点等位基因和基因型分布的比较

比较结果见表1。SZ 组与HC 组rs10800856 等位基因及基因型分布差异均有统计学意义（P=0.003，P=0.012），经Bonferroni 校正检验后，rs10800856 等位基因频率分布差异仍有统计学意义（P=0.015）；提示SZ 组等位基因A频率明显低于HC 组，等位基因T 频率明显高于HC 组，基因型频率分布差异无统计学意义。

2.7 不同遗传模式下的基因型分布比较

SZ 组和HC 组比较，rs10800856 位点在共显性及隐性遗传模式下基因型分布组间差异无统计学意义；在显性及加性遗传模式下，基因型分布组间比较差异有统计学意义（P=0.004，P=0.005），经Bonferroni 校正后差异仍具有统计学意义（P=0.020，P=0.026）；提示在显性遗传模式下A/A 基因型在SZ 组及HC 组之间比较差异有统计学意义，HC 组A/A 基因型显著多于SZ组（表2）。

表1 SZ组与HC组等位基因频率和基因型频率的比较Tab 1 Comparison of allele frequencies and genotype frequencies between the SZ group and HC group

表2 SZ组与HC组不同遗传模式下基因型的比较Tab 2 Comparison of genotype distribution in different models between the SZ group and HC group

Continued Tab

2.8 连锁不平衡分析及单倍型遗传关联分析

2.8.1 连锁不平衡分析 不同基因座位的各等位基因在人群中以一定的频率出现。在某一群体中，不同座位某2个等位基因出现在同一条染色体上的频率高于预期的随机频率的现象，称为连锁不平衡。应用HaploView 4.2 软件对SYT2 基因5 个SNP 位点进行连锁不平衡分析，单倍型频率＜3.0%将不被纳入后续分析。以D'值来衡量各位点之间的连锁不平衡程度，D'值＞0.8 可以构成一个单倍型区块。分析结果显示：SYT2 基因的rs6427957、rs907697这 2 个 SNP 位 点 以 及 rs12564274、 rs10800856、rs61820945 这3 个SNP 位点分别可以构成一个单倍型区块（图1）。

图1 5个SNP的连锁不平衡分析结果Fig 1 Results of linkage disequilibrium analysis of 5 SNPs

2.8.2 SZ 组与HC 组单倍型分析 应用SHEsis 在线软件对SZ 组及HC 组间单倍型进行分析，发现由rs6427957 和rs907697 位点构成的单倍型A-C、A-T、G-T 频率＞3%，继续分析发现3 个单倍型在2 组间分布差异无统计学意义（表3）。由rs12564274-rs10800856-rs61820945 位点组成的单倍型C-A-A、C-T-C、G-A-C、G-A-G 频率＞3%，后续分析发现单倍型C-T-C频率分布在SZ组与HC组间差异有统计学意义（P=0.009），经Bonferroni校正后，差异仍具有统计学意义（P=0.036，表4）。

表3 SZ组与HC组单倍型分布的比较（rs6427957和rs907697）Tab 3 Comparison of haplotype distribution between the SZ group and HC group（rs6427957 and rs907697）

表4 SZ组与HC组单倍型分布的比较（rs12564274、rs10800856和rs61820945）Tab 4 Comparison of haplotype distribution between the SZ group and HC group（rs12564274，rs10800856 and rs61820945）

3 讨论

神经发育假说是当前精神分裂症病因学解释的主要观点。该假说认为在胚胎期大脑内神经元及神经通路发育和成熟过程中出现紊乱，同时在外界的异常环境诱导下出现精神分裂症症状［15］。钙信号转导在调节神经元的多种生物学过程中起着核心作用，许多神经精神疾病的发生都与钙通道活性异常有关；越来越多的证据［16-17］表明，精神分裂症的发生与钙离子信号转导通路的失调有关。SYT2 主要调节Ca2+的释放，触发和调节囊泡与靶膜的融合过程，调节神经递质和激素的快速吞吐，在神经递质传递过程中扮演着重要的角色，因此SYT2 基因可作为精神分裂症遗传学研究的候选基因之一。

本研究在中国汉族人群中对SYT2 基因的5 个SNP 位点 rs10800856、 rs12564274、 rs61820945、 rs6427957、rs907697进行基因型、等位基因及单倍型频率的比较，研究结果发现rs10800856 等位基因及基因型频率分布在中国汉族人群精神分裂症患者和健康人群之间差异有统计学意义，经Bonferroni 校正后，rs10800856 位点基因型频率分布在组间的差异无统计学意义，等位基因频率间差异仍有统计学意义。rs10800856位点在显性及加性遗传模式下，基因型分布在SZ 组与HC 组之间比较差异有统计学意义，Bonferroni 校正后差异仍有统计学意义。由rs12564274-rs10800856-rs61820945 组成的单倍型C-T-C 频率分布在SZ 组与HC 组间差异有统计学意义，经Bonferroni 校正后，差异仍具有统计学意义。虽然rs10800856 位点基因型频率经Bonferroni 校正后无统计学意义，但Bonferroni校正可能会因过度保守而增加假阴性率，且rs10800856 等位基因频率经Bonferroni校正后在组间分布仍具有统计学意义，并且该位点在显性及加性遗传模式下，组间比较亦有统计学意义，表明rs10800856位点等位基因T 可能是精神分裂症的风险等位基因。因此，本研究认为rs10800856 位点基因的多态性可能与中国汉族人群精神分裂症的发生有一定关联。同时，本研究还发现由rs12564274-rs10800856-rs61820945 位点组成的单倍型C-T-C 在SZ 组和HC 组之间差异有统计学意义，其OR=1.359，表明C-T-C 单倍型可能会增加精神分裂症的患病风险；但本研究并没有发现除rs10800856 以外其他位点（rs12564274、rs61820945）与精神分裂症之间存在关联，考虑这可能是由于单倍型加强了各位点之间的联系所致。另外，本研究虽然在平均年龄间差异具有统计学意义，但由于基因具有相对稳定性的特点，因此认为年龄差异对结果的影响较小。综上所述，我们认为SYT2基因的多态性可能与精神分裂症的发病风险有关联，rs10800856可能是精神分裂症发病的风险位点。但有关该位点突变后是通过哪种方式对精神分裂症发病风险产生影响，目前还不明确，还需要进行进一步的研究。rs10800856 位点位于SYT2 基因上游启动子区域，该位点的突变可能会导致启动子结构的改变，进而影响它与RNA 聚合酶的亲和力，从而影响基因水平的表达。Wu等［18］在精神分裂症相关的转录多样性的研究中发现了12个与编码SNARE 复合物相关蛋白有关的基因，这些基因均来自突触小泡运输簇，因此他们认为SNARE 复合物可能在精神分裂症的突触前功能障碍中具有重要作用。在这12 个基因中，SYT2 基因便是其中一个，并且该研究还在与SYT2基因功能相似的SYT1基因中进一步检测到了替代启动子的使用。基于此，我们猜测，rs10800856位点的突变可能会对突触前功能产生一定影响，进而影响神经递质的释放，使精神分裂症的发病风险增加。

本研究选取的SYT2 的5 个SNP 位点在精神分裂症中均未见报道，同时还发现SYT2 基因rs10800856 位点多态性与rs12564274-rs10800856-rs61820945 位点组成的单倍型C-T-C 可能与精神分裂症的发生有关，证实了SYT2 基因可能为精神分裂症的易感基因，具有一定的创新性。但本研究仍存在一定的局限性。首先，精神分裂症的发生并不是单个基因决定的，而是由多个基因及其他因素共同作用的结果，因此，其他基因与SYT2 相互作用对于精神分裂症的发生仍是未来研究的一个重点；其次，本研究的样本量较小，在今后的研究中应进一步扩大样本量再次进行重复验证，同时本研究仅选取了SYT2 基因的5 个SNP 位点进行关联分析，虽然这5 个位点是经过筛选得到的，但反映的信息仍较少，不足以反映SYT2 基因的全部信息；再次，关于样本的一致性，不同的临床表型可能会对研究结果产生一定的影响，本研究在选取样本时缺少同质性，可能会对结果产生一定的影响，因此，在今后的实验中需尽可能地选取临床表型一致的个体进行研究，使研究更加严谨可信；最后，本研究仅为探讨SYT2 基因多态性与精神分裂症相关性的初步研究，对于该基因多态性导致的精神分裂症相关蛋白的变化及其所引起的病理生理的改变，仍需要进行进一步的探讨。在未来的研究中，我们仍需要设计更加严谨的实验方案，通过大样本量进行重复研究，对SYT2 基因的多态性与精神分裂症的关联性做进一步验证。