腹膜透析滤出液外泌体miR-200a 在不同腹膜转运特性患者中的表达差异及其生物学功能预测

佟 琰，方均燕，邓 海，宋阿会，李 璞，刘英莉

上海交通大学医学院附属第九人民医院肾内科，上海200011

腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）利用人体自身的腹膜作为透析膜，清除体内的毒素和过多的水分［1］。溶质通过腹膜的速度，即腹膜溶质转运率（peritoneal solute transport rate，PSTR），是评价腹膜性能的重要指标。临床上常通过腹膜平衡试验（peritoneal equilibrium test，PET）对PSTR 进行评估，按照4 h 腹膜透析滤出液/血浆肌酐浓度比值（4h D/PCr）数值分为高转运（0.82～1.03）、高平均转运（0.65～0.81）、低平均转运（0.50～0.64）和低转运（0.34～0.49）［2-3］。腹膜高转运状态的患者容量清除较差，更容易出现水钠潴留、超滤衰竭和腹膜纤维化等PD 相关并发症［4-5］。上皮细胞的间充质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是腹膜纤维化形成的重要病理生理过程［6］。在一项PD 大鼠动物模型的研究［7-8］中发现，腹膜纤维化早期miR-200a 的表达减少，并且miR-200a 可以通过靶向E 盒结合锌指蛋白1/2 （zinc finger E-box-binding homeobox 1/2，ZEB1/2）负向调节转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）诱导的EMT。腹膜高转运状态与腹膜纤维化直接相关，而miR-200a 作为与腹膜纤维化显著相关的miRNA，其与腹膜高转运状态之间的关系尚未见报道。

外泌体是一类直径为30～150 nm的细胞外囊泡，内含蛋白质、RNA和脂质等成分，电子显微镜下观察呈杯状。外泌体可由多种细胞分泌，也存在于多种体液中，如血液或尿液。腹膜透析滤出液（peritoneal dialysis effluent，PDE）是PD 患者独特的临床样本，取材简便，标本易得。许多研究发现PDE 中的白介素-6 （interleukin-6，IL-6）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、 单 核 细 胞 趋 化 蛋 白1 （monocyte chemoattractant protein 1，MCP1）和基质金属蛋白酶2（matrix metallop roteindse 2，MMP2）等细胞因子［9-11］，胰脂肪酶［12］及一些miRNA 可能与腹膜高转运状态相关。另有研究［13-14］发现直接从PDE 或PDE 离心后所得沉淀中提取到的细胞内miRNA 也与腹膜转运特性相关。本研究不同于既往研究，所提取的PDE 外泌体miRNA 主要为细胞外miRNA，外泌体双层磷脂膜结构的包裹使其较游离miRNA更稳定，且可发挥信息传递的作用。

本研究通过提取PDE 中的外泌体miRNA，比较外泌体miR-200a 在不同腹膜转运特性患者中的表达差异，探索其是否与腹膜转运特性相关，是否能成为监测腹膜状态改变的一种新型分子标志物，并利用生物信息学分析预测miR-200a及其靶基因影响腹膜转运特性的相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验样本收集

选取于上海交通大学医学院附属第九人民医院行维持性PD 的患者，透析方案均为持续性不卧床腹膜透析，夜间留腹6～10 h，日间留腹方案可不同。患者年龄18～80 岁，连续3 次PET 值提示其转运特性为稳定的高转运/高平均转运或低转运/低平均转运；据此将患者分为H 组（高转运/高平均转运）和L 组（低转运/低平均转运）。近3 个月内发生过腹膜炎或其他部位感染者、恶性肿瘤患者、有肝炎或结核病史的患者及自身免疫疾病患者均不予纳入研究。最后，纳入H 组和L 组各10 例患者，收集这些患者的基本临床资料。本研究于上海交通大学医学院附属第九人民医院科研伦理审查委员会备案（审批号SH9H-2020-T23-1）。

1.2 外泌体的提取

收集PD 患者行PET 前1 d 留腹过夜的PDE 500 mL，经截留相对分子质量为10 000 的再生纤维素膜在超滤杯（Millipore，美国） 中浓缩至40 mL；于2 500×g 离心15 min 去除浓缩液中的细胞碎片后，18 000×g 高速离心30 min；0.22 μm 孔径滤器过滤，去除上清液中的大分子物质；在超速离心机中（Beckman，美国）120 000×g 离心2 h，加入PBS再次120 000×g离心清洗2 h后弃去上清液；用200 μL PBS 重悬，得到外泌体。所有离心过程均于4 ℃下进行。外泌体提取后立即提取miRNA 或保存于-80 ℃。

1.3 外泌体的鉴定

透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）（FEI，美国）用于观察外泌体的形态和大小。纳米粒子跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）系统（PMX，德国）用于分析外泌体的粒径和浓度。Western blotting检测外泌体表面标志蛋白CD9和CD63。

1.4 Western blotting检测蛋白CD9和CD63

10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上；5%牛奶封闭2 h 后，抗CD9和抗CD63（1∶1 000，SBI，美国）抗体4 ℃孵育过夜；二抗（1∶5 000，proteintech，美国）室温孵育1 h；滴加ECL显影液后在化学发光显影仪下显影。

1.5 外泌体miRNA提取

用miRNeasy（Qiagen，德国）提取外泌体miRNA；在外泌体中加入5 倍体积的TRIzol、3.5 μL 外参cel-miR-39，以及与外泌体等体积氯仿；4 ℃下12 000×g 离心15 min，取上清液加入1.5倍体积100%乙醇；所得混合液经过RNeasy spin column 12 000×g 反复离心洗涤；用去RNA酶水洗脱膜上的RNA，将所得RNA进行定量。

1.6 实时荧光定量PCR检测外泌体miR-200a的表达

采用miDETECT A TrackTMmiRNA 试剂盒（广州锐博，中国）将外泌体miRNA 经过加polyA 尾反转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测。PCR扩增条件：预变性95 ℃10 min；变性95 ℃2 s，退火60 ℃20 s，延伸70 ℃10 s，重复40 个循环。以miR-39为外参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量。

1.7 靶基因预测及功能富集

使用在线数据库Targetscan、miRmap 和miRWalk 进行miRNA 的靶基因预测分析。采用String 数据库（https：//string-db.org/）预测相关蛋白，采用Cytoscape 软件将蛋白间相互作用关系（protein-protein interaction，PPI）进行可视化，采用MCODE 插件将其进行模块化。采用DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行靶基因功能富集（gene ontology，GO）分析，RStudio 软件作图。

1.8 统计学分析

采用Graphpad Prism 8.0 软件进行统计学分析。符合正态分布的定量资料用x±s 表示，组间比较采用t 检验；非正态分布的数据用M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-Whitney U 检验。定性资料组间比较采用Fisher 确切概率法。相关性分析采用Spearman 秩相关分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PDE外泌体的鉴定

通过超速离心法得到的浓缩后PDE 中的外泌体，在TEM 下呈圆形双层膜包裹的囊泡结构（图1A）；NTA 检测多数囊泡直径介于50～150 nm （图1B）；Western blotting 结果显示其具有外泌体表面标志物CD9 和CD63（图1C）。

图1 PDE外泌体的鉴定Fig 1 Identification of PDE exosomes

2.2 miR-200a在2组PDE外泌体中的表达差异

20 例患者的基本信息见表1。H 组和L 组患者男女比例、年龄、透析龄、估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）、尿素清除指数（Kt/V）比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。2 组PET 值比较，差异具有统计学意义（P=0.000）。以miR-39为外参，RT-qPCR 结果显示（图2）：L 组PDE 外泌体miR-200a 的表达水平高于H组，差异具有统计学意义（P=0.000）。

2.3 miR-200a与PET值、4 h超滤量和24 h超滤量的相关性

将PET 结束时的超滤量作为4 h 超滤量，患者行PET前24 h 内的总超滤量作为24 h 超滤量。对H 组和L 组miR-200a 的相对表达量分别与PET 值、4 h 和24 h 超滤量进行相关性分析，结果（图3）显示：PDE 外泌体miR-200a/miR-39 与PET 值呈负相关（r=-0.871，P=0.000），与4 h 超滤量呈正相关（r=0.448，P=0.048），但其与24 h超滤量无相关性（r=0.355，P=0.125）。

表1 PD患者的临床资料Tab 1 Clinical characteristics of PD patients

图2 2组PDE外泌体miR-200a表达水平的比较Fig 2 Comparison of expression of PDE exosomal miR-200a between the two groups

2.4 miR-200a靶基因预测及分析

通过Targetscan、miRmap 和miRWalk 3 种miRNA 靶基因在线预测数据库共同预测到的miR-200a 靶基因有679 种（图4A）。选取参与EMT 相关的GO 功能——GO 0002053 正向调节间充质细胞增殖的靶基因，发现有6 种基因富集在此生物过程中，分别为矮小同源盒基因（short stature homeobox 2， SHOX2）、 WNT 家 族5A（WNT family member 5A，WNT5A）、成纤维细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor 1， FGFR1）、转化生长因子βⅡ型受体（transforming growth factor β receptor 2，TGFBR2）、肿瘤蛋白p63（tumor protein p63，TP63）、叉头框蛋白P1（forkhead box P1，FOXP1）；再利用String 数据库构建EMT 相关靶基因表达的蛋白与其他蛋白之间的PPI；最后使用Cytoscape软件的MCODE功能进行模块分析。结果显示，2 个靶基因聚集在模块中，参与纤维化过程的发生和进展（图4B）。

图3 PDE外泌体miR-200a与PET值、4 h和24 h超滤量的相关性分析Fig 3 Correlation analysis between PDE exosomal miR-200a and PET values,4 h and 24 h ultrafiltration volume

图4 miR-200a潜在靶基因预测及EMT相关靶基因表达蛋白的PPI模块Fig 4 Prediction of target genes of miR-200a and PPI modules of EMT-related target genes expressing proteins

2.5 miR-200a靶基因功能分析

为进一步研究miR-200a 在PD 中的作用，将679 个靶基因输入到DAVID 数据库中进行GO 分析（P＜0.05），包括 分 子 功 能（molecular function， MF）、 细 胞 组 分（cellular component， CC）、 生 物 学 过 程（biological process，BP）3 个部分（图5）。结果显示：miR-200a 的靶基因参与了许多重要的细胞组分；其参与的生物学过程不仅包括正向调控间充质细胞增殖，同时也能正向调控内皮细胞迁移，并参与调控凋亡过程和蛋白磷酸化；分子功能方面显示其可能影响ATP、DNA 和mRNA 等的结合过程，在金属离子结合方面也有一定的富集。值得注意的是，溶质载体（solute carrier，SLC）家族中有多种蛋白的编码基因均为miR-200a 的靶基因。SLC 家族为典型的跨膜蛋白，负责氨基酸、核苷酸、葡萄糖、无机离子和药物等物质的吸收和运输［15-17］，如SLC9A5［也称为钠氢转运体5（NHE5）］、SLC10A1 为钠/胆汁酸协同转运蛋白，SLC17A4 为钠/磷酸盐共转运蛋白。此外，编码钠离子电压门控通道（sodium voltage-gate channel，SCN）亚基蛋白也可能为miR-200a 的靶点。由此推测，miR-200a 除影响EMT 或细胞凋亡等过程外，还可能通过调控离子结合、离子转运，影响各种离子、小分子等溶质转运，从而参与腹膜高转运状态的发生过程。

图5 miR-200a靶基因的GO富集分析Fig 5 GO enrichment analysis of miR-200a target genes

3 讨论

PD 是终末期肾脏病（end-stage renal disease，ESRD）患者的主要肾脏替代治疗方法之一，具有血流动力学稳定、中分子清除效率好、居家治疗安全方便等优点。PD患者的中期（至少5年）生存率基本等同于血液透析患者的生存率［18］。虽然PD 技术在不断发展和改进，但是腹膜形态和功能的改变仍会导致患者出现一些并发症，影响患者的透析质量。腹膜高转运状态与腹膜纤维化、超滤衰竭和技术失败密切相关［5］，因此及时有效地获得腹膜转运特性的信息对早期预防和诊断相关并发症具有重要意义。

外泌体是由细胞分泌的特异性囊泡，参与细胞间通信，发挥多种功能［19］。利用来自血液或尿液的外泌体miRNA 作为诊断疾病的生物标志，也是“液体活检”的一种新兴方法，但很少有研究报道PDE 中的外泌体及其组成。2017 年，Carreras-Planella 等［20］首次报道了PDE中细胞外囊泡的存在并予以分离；随后相关研究［21］通过多种方法，如差速离心、排阻色谱法以及纳米颗粒跟踪分析等证实这些囊泡大多数为外泌体。本研究将浓缩后的PDE 进行超速离心，并利用TEM、NTA 和Western blotting等方法鉴定，成功提取到了PDE来源的外泌体。

研究发现，miR-200a 可能通过调节SIRT1/Notch1 信号 通 路［22］以 及miR-200a/Smad7/TGF- β1/EMT/MAPK轴［23］参与抗肝脏纤维化的过程，也可通过抑制ZEB1/2改善腹膜纤维化［7-8］，但未发现miR-200a与腹膜高转运状态相关。本实验将20 例PD 患者按照PET 值分为H 组和L 组，提取PDE 外泌体miRNA，结果发现外泌体miR-200a 在L 组的相对表达量较高，并且其表达量与PET 值呈一定程度的负相关关系，与4 h 超滤量呈正相关关系，但与24 h超滤量并无相关性。

Targetscan 是最常用的miRNA 靶基因预测数据库之一，提供多物种信息，通过与miRNA 种子区域匹配的保守的8mer 和7mer 位点来预测靶基因。miRWalk 记录了基因全长序列上的miRNA 结合位点，也将其与已有的12个miRNA靶标预测程序的预测信息进行结合关联。miRmap将涵盖11 种预测特征的4 种方法集合在一个模型中，预测能力较强。为避免预测假阳性，本研究同时使用3个数据库，对其共同预测到的基因交集进行分析。在对预测到的miR-200a 靶基因进行GO 分析后，本研究选取EMT相关的GO 功能组，对6 个靶基因表达蛋白进行PPI 模块分析，发现FGFR1 和TGFBR2 主要聚集在2 个模块，通过参与相关信号通路促进间充质细胞增殖，从而促进纤维化。此外，对miR-200a 的GO 分析结果也显示，其靶基因在组成细胞成分、调控凋亡过程以及参与ATP、DNA、mRNA和金属离子结合方面有一定富集。

本研究成功提取并鉴定了PDE 来源外泌体，探究了PDE 外泌体miR-200a 与转运特性的关系，也对miR-200a进行了靶基因预测和GO富集分析；发现其靶基因中有许多SLC 家族蛋白，可能在离子结合、离子和溶质转运等方面具有一定的调控功能。本研究为探讨miRNA 如何影响腹膜转运特性的机制问题提供了新思路。但本研究只选取了20 例PD 患者，样本量较少，具有一定的局限性。首先，本研究未观察到miR-200a 的相对表达量与24 h 超滤量的相关性；分析原因可能为影响24 h 超滤量的因素较多，如PD 方案、患者残肾功能和24 h 尿量。若要证明PDE 外泌体miR-200a 可成为判断腹膜转运特性的标志物及其与24 h 超滤量的关系，需要多中心、大样本的研究进行验证。其次，本研究没有确定PDE 外泌体的来源。腹膜组织主要由间皮细胞组成，腹膜腔内也有一些免疫细胞，如巨噬细胞、淋巴细胞等［24］；因此，PDE 外泌体可能由多种细胞分泌，可进一步检测外泌体表面蛋白，鉴别其具体来源。再次，我们只选取了miR-200a 作为目标miRNA，还有一些参与多种功能调控的miRNA，如miR-21，值得在后续实验中进一步讨论。最后，我们通过生物信息学分析，认为miR-200a 可能通过调控SLC 家族影响离子结合或离子转运，但未进行实验验证，相关分子机制和信号通路仍需深入研究。

综上所述，本研究通过提取PDE 外泌体，比较外泌体miR-200a 在不同腹膜转运特性患者PDE 中的表达，发现转运特性较低的患者PDE 外泌体miR-200a 的相对表达量较高，并且miR-200a的相对表达量与PET值呈负相关，与4 h 超滤量呈正相关；但其与24 h 超滤量是否相关，是否影响离子结合及相关作用机制需要更多实验进一步探讨。