飞燕草素对光化学损伤661W细胞的保护作用及其机制△

邓晓敏 傅晓颖 彭佳媛 吴蔼林 李沁轩 杜旌畅 陈玮 朱彦锋 余小平

随着手机、电脑等电子产品的普及，光污染对视网膜的损伤及其继发的眼科疾病逐渐成为严重的公共健康问题[1]。常见电子产品多以发光二极管(LED)作为屏幕背光模块，LED光是光污染的主要来源，更是造成视网膜光化学损伤(retinal photochemical damage，RPD)的主要元凶[2]。RPD与细胞氧化反应密切相关，是视网膜光损伤中最常见的类型[3]。研究发现，在光化学损伤的感光细胞中活性氧(ROS)生成增多、脂质过氧化物堆积、酶蛋白失活，进而导致细胞线粒体生理功能障碍，细胞结构发生改变，最终细胞走向凋亡甚至坏死[4]。长期RPD可诱发老年性黄斑变性或视网膜色素变性，严重损伤患者视力[5]。目前临床预防RPD的主要手段是配戴防护器具和减少光源接触时间，尚未发现针对RPD的特效药物。

花青素存在于果蔬或花卉中，是具有较强抗氧化作用的黄酮类化合物，主要有六种单体成分：矢车菊素(50%)、飞燕草素(12%)、锦葵花素(12%)、天竺葵色素(12%)、芍药花青素(7%)和牵牛花色素(7%)[6]。其中，飞燕草素花色苷丰度高、羟基数量较多且清除超氧化物自由基的效力最强[7]。我们前期研究已证明，飞燕草素可通过调控氧化-抗氧化系统有效减轻光化学因素导致的视网膜损伤[8]。本研究拟使用白色LED灯照射661W细胞构建RPD模型，并采用飞燕草素与抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)分别干预，进一步探讨飞燕草素调控感光细胞氧化应激线粒体凋亡通路的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验分组将661W细胞放入含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，置于含体积分数5%CO2、37 ℃培养箱中常规培养。选取状态良好的指数生长期细胞进行研究。根据预实验结果采用(2000±200)lux光照强度持续照射细胞48 h作为造模条件，采用5 μmol·L-1飞燕草素、3 mmol·L-1NAC为最佳用药浓度。细胞分组如下：(1)对照组，常规避光培养48 h；(2)光照组，(2000±200)lux光照培养48 h；(3)光照飞燕草素组，(2000±200)lux光照培养24 h，换含5 μmol·L-1飞燕草素的培养基继续光照培养24 h；(4)避光飞燕草素组，避光培养24 h，换含5 μmol·L-1飞燕草素的培养基继续避光培养24 h；(5)光照NAC组，(2000±200)lux 光照培养24 h，换含3 mmol·L-1NAC的培养基继续光照培养24 h。

1.2 试剂与仪器661W细胞株(上海奥陆生物有限公司)，飞燕草素、NAC(美国Sigma公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，DMEM高糖培养基(美国Hyclone公司)，CCK-8试剂盒(日本同仁公司)，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、活性氧检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，细胞线粒体膜电位检测试剂盒(江苏凯基公司)，iNOS抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体、细胞色素C抗体(武汉三鹰公司)，GAPDH抗体(北京中杉金桥公司)，Caspase-3抗体、兔二抗、鼠二抗(美国CST公司)。细胞光照培养箱(自制，专利证书号：ZL 201821939405.1)，Power Wave XS2酶标仪(美国BioTek公司)，QuanteonTM流式细胞仪(杭州艾森公司)，电泳仪、ChemiDoc化学发光凝胶成像检测仪(美国BIO-RAD公司)。

1.3 方法

1.3.1 显微镜下观察细胞状态将细胞接种于6孔板，每孔150×103个细胞，对照组常规培养，光照组采用(2000±200)lux光照培养，分别于光照后12 h、24 h、48 h镜下观察并拍照。

1.3.2 CCK-8检测细胞生存率将各组细胞接种于96孔板，每孔5×103个，每组设3个复孔。建模后参照CCK-8试剂盒说明书检测各组光密度(D)值，并按公式计算细胞生存率。

1.3.3 DCFH-DA荧光探针染色检测细胞ROS水平将细胞接种于6孔板，每孔150×103个，分组处理后收集各组细胞，用PBS洗2遍，弃上清。每组加500 μL探针染液悬浮细胞，37 ℃避光孵育20 min，采用流式细胞仪FITC通道检测各组平均荧光强度。

1.3.4 JC-10染色检测线粒体膜电位在ROS实验基础上加设阴性对照组(不加JC-10)和阳性对照组(11000稀释Triton-100作用10 min诱导细胞凋亡)。分组处理后收集各组细胞，每组加500 μL JC-10工作液37 ℃避光孵育20 min，清洗后以500 μL Incubation Buffer重悬细胞，采用流式细胞仪PE/FITC通道检测各组平均荧光强度。

1.3.5 Annexin V-FITC/ PI染色检测细胞凋亡率造模方案与JC-10染色实验相同，分组处理后收集细胞，每组加入500 μL Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI混匀，室温避光孵育15 min，采用流式细胞仪PE/FITC通道检测各组细胞凋亡率。

1.3.6 Western blot检测各组细胞氧化应激线粒体凋亡通路相关蛋白表达水平收集分组处理后的661W细胞，提取细胞总蛋白，BCA定量并变性。每孔50 μg上样量，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转膜、封闭后分别加iNOS、Bax、Bcl-2、细胞色素C、Caspase-3、GAPDH一抗溶液4 ℃ 摇床孵育过夜。用TBST清洗3次，加兔二抗、鼠二抗37 ℃摇床孵育1 h，TBST清洗6次，再以ECL发光液显影曝光，保存条带并用Image J软件分析灰度值。

1.4 统计学分析实验所获数据均采用SPSS 25.0统计学软件进行统计学分析，结果以均数±标准差表示，所有实验至少重复3次。两组以上比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD法。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 光照对细胞状态的影响显微镜下可见，对照组细胞生长状态良好，贴壁细胞数量随时间增加而增加，形态无明显变化；光照组细胞皱缩卷曲，贴壁细胞数较对照组明显减少，脱落细胞增加(图1)。

图1 光照对各组661W细胞状态的影响 箭头指示脱落细胞。

2.2 各组细胞生存率CCK-8检测结果显示：与对照组相比，光照组细胞生存率明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；避光飞燕草素组细胞生存率无明显变化(P>0.05)。与光照组相比，光照飞燕草素组、光照NAC组和避光飞燕草素组细胞生存率均明显回升，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见表1)。

2.3 各组细胞ROS含量无荧光的DCFH-DA探针可被ROS氧化成荧光物质DCF，其荧光强度与ROS含量成正比。各组ROS平均荧光强度见表1。检测结果显示：与对照组相比，光照组ROS含量明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)；避光飞燕草素组ROS含量减少不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。与光照组相比，光照飞燕草素组、光照NAC组和避光飞燕草素组ROS含量均明显下降，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

表1 各组细胞生存率、ROS平均荧光强度、JC-10平均荧光强度、细胞凋亡率

2.4 各组细胞线粒体膜电位水平线粒体膜电位指示剂JC-10在线粒体膜电位较高时散发红色荧光，电位降低时散发绿色荧光，荧光信号强弱与电位高低成正比。各组JC-10平均荧光强度见表1。检测结果显示，与对照组相比，光照组线粒体膜电位明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；避光飞燕草素组线粒体膜电位变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。与光照组相比，光照飞燕草素组、光照NAC组和避光飞燕草素组线粒体膜电位均明显上升，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

2.5 各组细胞凋亡率Annexin V-FITC/ PI染色结果显示，与对照组相比，光照组细胞凋亡率明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；避光飞燕草素组细胞凋亡率变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。与光照组相比，光照飞燕草素组、光照NAC组和避光飞燕草素组细胞凋亡率均明显降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见表1)。

2.6 各组细胞氧化应激线粒体凋亡通路相关蛋白表达水平Western blot检测结果如图2所示，与对照组相比，光照组细胞的iNOS、Bax、细胞色素C、Cleaved-Caspase-3蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调，Bcl-2/Bax值下降明显，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；而避光飞燕草素组细胞的上述蛋白表达变化不明显，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。与光照组相比，光照飞燕草素组、光照NAC组和避光飞燕草素组的iNOS、Bax、细胞色素C、Cleaved-Caspase-3蛋白表达均下调，Bcl-2蛋白表达均上调，Bcl-2/Bax值均明显上升，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见表2)。

图2 各组细胞氧化应激线粒体凋亡通路相关蛋白表达情况 A:对照组；B:光照组；C:光照飞燕草素组；D:避光飞燕草素组；E:光照NAC组。

表2 各组细胞氧化应激线粒体凋亡通路相关蛋白表达水平

3 讨论

视觉形成需要一定量的光刺激，而视网膜感光细胞过度暴露于光线下可能导致RPD并继发视网膜色素变性或老年性黄斑变性等眼科疾病[5]。现有的防护措施多为物理隔离，针对RPD病理特征及其发病机制的干预措施尚在探索中。花青素是具有较强抗氧化作用的黄酮类化合物，常存在于果蔬和花卉中。近年来大量研究发现，花青素具有抗氧化性，对视网膜感光细胞[8-9]、心肌细胞[10]、肝细胞[11]均有保护作用，但其具体效应成分及防护机制尚未明确。因此，我们前期选取抗氧化性最强的飞燕草素单体，证明了其在661W细胞和SD大鼠模型中均能降低脂质过氧化物TBARS含量，调节抗氧化酶SOD、GSH-Px、GST活性，有效减轻RPD的作用[8]。在此基础上，本研究以飞燕草素干预RPD模型并加设光照NAC组作为阳性对照，旨在探究飞燕草素调控氧化应激线粒体凋亡通路抗RPD的作用及其分子机制。

本研究结果显示，光照后细胞形态改变、脱落增多、存活率下降且凋亡率升高，证明RPD模型构建成功。相较于光照组，光照飞燕草素组和光照NAC组因药物干预，细胞存活率升高，细胞凋亡率下降，提示飞燕草素与抗氧化剂 NAC对光损伤的661W细胞均具有保护作用。同时我们发现，避光飞燕草素组相较于对照组，各项指标变化均无统计学意义，提示飞燕草素对健康661W细胞无细胞毒性。类似研究发现，用200 lux白色LED光持续照射大鼠7 d可导致RPD，视杆细胞和视锥细胞凋亡增加[2]。此外，Silvan等[12]发现花青素与叶黄素可提高光损伤的视网膜色素上皮细胞活力，并通过调节MAPK通路因子表达，减少细胞凋亡率。以上研究提示，飞燕草素可通过减少RPD降低视网膜感光细胞凋亡率，从而对可能继发的眼科疾病起到预防作用。

进一步研究发现，RPD与氧化应激密切相关[13]，线粒体是细胞产生ROS的主要部位，本研究通过检测各组细胞ROS含量及线粒体膜电位的变化，探究氧化应激与RPD的关系。本研究发现，光照后细胞ROS生成增多，线粒体膜电位降低。相较于光照组，用飞燕草素或NAC干预后的两组细胞ROS含量显著减少，线粒体膜电位上调。Shivarudrappa等[14]研究表明，高糖能诱发人视网膜上皮细胞(ARPE-19)发生氧化应激，由此产生的过量ROS可导致细胞氧化-抗氧化系统失衡，进而诱发凋亡。Kim等[15]发现飞燕草素具有较强的抗氧化性，可清除辐射诱导的ROS并调节氧化酶活性，减轻低剂量质子束照射所导致的肺细胞损伤。Seo等[16]研究还发现，飞燕草素可减少胚胎干细胞ROS含量，调节其线粒体膜电位，减少因缺氧诱导的小鼠胚胎干细胞凋亡。由此可以推测，飞燕草素可能通过减少ROS含量，平衡细胞氧化-抗氧化系统，调节线粒体膜电位，进而减少细胞死亡。

RPD继发的线粒体氧化应激功能障碍是导致细胞凋亡的主要原因，表现为ROS直接作用于线粒体导致Bcl家族蛋白活化形成通透性转变孔。而通透性转变孔开放增加了线粒体膜通透性，促凋亡因子如细胞色素C等释放增多，随之引发下游级联反应[17]。本研究以Western blot检测氧化应激和凋亡相关蛋白表达发现，光照后氧化应激相关蛋白iNOS表达升高，促凋亡蛋白Bax、细胞色素C表达升高，凋亡标志性蛋白的活化形式Cleaved-Caspase-3表达升高，抗凋亡的Bcl-2蛋白表达降低，Bcl-2/Bax值明显降低，细胞趋向凋亡。使用飞燕草素或NAC干预后，以上指标表达水平变化均有不同程度的逆转，Bcl-2/Bax值明显回升，提示细胞趋向凋亡耐受。iNOS为诱导型一氧化氮合酶，其表达水平升高提示细胞可能处于氧化应激状态。Piehl等[18]研究证明，白光照射大鼠可导致其视网膜细胞发生氧化应激，表现为ROS升高，iNOS表达显著增加。Hu等[19]研究发现，反式2,4-癸二烯醛可诱导大鼠动脉细胞发生氧化应激，ROS含量和iNOS表达增加，最终导致血管内皮细胞凋亡增加。而在RPD模型中，氧化应激介导的凋亡是细胞最主要的死亡途径[20]。Zhao等[21]发现，氧化应激可直接激活心肌细胞线粒体凋亡途径，改善线粒体功能障碍，可能成为心血管疾病治疗的新靶点。有趣的是，Van de Velde等[22]研究发现，用花青素对愈合伤口中的巨噬细胞和成纤维细胞进行干预，均产生抗氧化应激作用，并可降低iNOS蛋白表达。除此之外，Seo等[16]研究发现，在小鼠胚胎干细胞氧化应激模型中飞燕草素可以清除ROS，调节氧化平衡，降低凋亡相关蛋白Bax、Cleaved-Caspase-9、Cleaved-Caspase-3的表达从而减少凋亡。综上，我们认为飞燕草素可能通过减少RPD时的氧化应激维持细胞氧化-抗氧化系统平衡，进而保护线粒体，减少该途径介导的凋亡，维持器官功能正常。