磷酸二酯酶抑制剂调控小胶质细胞活化治疗青光眼的研究进展△

王雪婷 党亚龙 魏菁 雷方

人类获取外界信息的80%由眼睛得到，视觉功能对人类的生活质量至关重要[1]。当今，青光眼是导致视力不可逆性损伤的首要原因[2]。青光眼的类型繁多，但其均以进行性视网膜神经节细胞(RGC)损伤和相应视野丧失为特征。青光眼发病机制复杂，遗传[3]、免疫微环境[4]和微生物感染[5]等与之密切相关。从临床角度讲，青光眼的特征是眼压升高或跨筛板压力差的出现[6]。从分子生物和细胞生物学角度看，视神经的炎症是青光眼致病的一个重要因素。视网膜小胶质细胞活化后产生大量炎症因子是青光眼性RGC死亡的主要发病机制之一，已成为当今研究热点[7-8]。作者前期研究表明，罂粟碱等磷酸二酯酶抑制剂能够有效抑制视网膜小胶质细胞炎症，保护神经节细胞。本文就磷酸二酶酶抑制剂通过调控小胶质细胞活化治疗青光眼的研究进展进行综述。

1 小胶质细胞

中枢神经系统(CNS)的胶质细胞可分为源于神经外胚层的大胶质细胞和来源于造血干细胞的小胶质细胞[9]。小胶质细胞的前体由骨髓迁移到CNS后，在视网膜、大脑和脊髓中定居，并逐渐分化、成熟，承担了重要的免疫调节作用[10]。虽然其体积只有神经节细胞的一半，但数量却是神经节细胞的5～10倍[11]。由于血-视网膜屏障的存在，血液中的大多数抗体不能到达眼内。因此，当感染源穿过血-视网膜屏障后，小胶质细胞的识别、吞噬、呈递抗原及分泌炎症因子的作用就尤为重要[12]。

小胶质细胞的功能与其表型有关[13]。生理状态下，小胶质细胞呈“树枝状”，细胞核小，分枝多,其释放的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)可维持突触的适应性[13]。当微生物入侵或细胞受损时，小胶质细胞会迁移位置，转变为活化状态，此时呈阿米巴样。在CNS的炎症早期，小胶细胞活化后可以发挥限制炎症扩散、吞噬病原体及死亡神经元的作用，清除碎片与死亡的细胞残体。但随着炎症的发展，慢性的异常活化的小胶质细胞会不断释放炎症介质及细胞毒性因子，过度吞噬受损的神经元，导致附近健康的神经元也受到损伤。因此，控制小胶质细胞的异常活化可以起到保护神经元的作用[12,14]。

1.1 青光眼与小胶质细胞活化青光眼是一种慢性的视神经退行性病变。由RGC轴突组成的视神经在致病因素的作用下，发生免疫活化、轴突的轴浆流中断、视神经纤维萎缩，从而引起视觉损伤[15]。在青光眼导致的急性神经炎症早期，小胶质细胞一般被认为是有益的，有助于维持神经系统的内稳态，但是慢性长期的神经炎症往往造成神经节细胞的不可逆损伤[16]。在巩膜表层静脉烧灼诱导的青光眼模型中，眼压升高后72 h即可检测到活化的视网膜小胶质细胞。死亡的RGC被活化的小胶质细胞包围，活化的小胶质细胞释放大量肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-10等炎症因子[17]，造成视神经损伤。在人体，青光眼患者的筛板及筛板周围血管也发现大量活化的小胶质细胞聚集[18]。RGC的死亡与小胶质细胞的活化与增殖密切相关。

1.2 小胶质细胞的表型小胶质细胞大致可分为2种状态：静息状态和活化状态[19]。在静息状态下，视网膜小胶质细胞呈双极或分支状，部分可见1～2个胞突。在创伤、缺氧及炎症的情况下，小胶质细胞发生形态学变化，由树状变为阿米巴样，同时，细胞发生迁移。在吞噬触发因子之后，变为抗原提呈细胞，分泌炎症因子，维持细胞稳态。小胶质细胞活化后的功能与RGC的存活密切相关。活化后的小胶质细胞释放大量炎症因子，包括TNF-α、IL-1β、一氧化氮(NO)等[20-21]，这些炎症因子的释放有利于清除病原体及细胞碎片。此外，小胶质细胞还会释放IGF-1，有利于清除坏死组织[22]。然而，在慢性炎症过程中，过度激活的小胶质细胞分泌过量炎症因子，发挥过度增强的吞噬能力，则会对健康的神经节细胞造成再一次伤害。

小胶质细胞在受到损伤时可发生2种不同的表型：M1型及M2型。M1型是神经毒性型，释放大量炎症因子。同时细胞的吞噬能力和运动能力均增强[23]。当受到创伤等外源性刺激时，小胶质细胞快速转变为M1型，过度激活，释放大量炎症介质。这些介质可以通过向损伤部位招募其他免疫细胞，放大炎症反应[24]。M2表型则不同，在此表型下的小胶质细胞分泌抗炎介质及神经保护因子，为稳定神经元的免疫微环境做出贡献。这2种表型的转换过程即是小胶质细胞功能变化的动态过程。

2 环磷酸腺苷与小胶质细胞活化

环磷酸腺苷(cAMP)是一种重要的第二信使，其信号通路存在于各种类型细胞中，参与调节CNS的多种生物学效应。腺苷酸环化酶(adenylyl cyclases,ACs)催化三磷酸腺苷(ATP)合成cAMP。内源性或外源性地激活ACs受体不仅可以提高cAMP水平，还可以降低眼压，提高RGC存活率[25]，但是目前尚无研究证实升高cAMP降低眼压的机制。

2.1 cAMP通过激活cAMP/PKA/CREB抑制核因子κB炎症通路cAMP通过cAMP/PKA/CREB 通路促进环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)的磷酸化，竞争性结合核因子κB(NF-κB)的配体P300及CBP，从而抑制了NF-κB的转录活性，降低炎症因子转录(图1)[26]。 Park等[27]发现，阻止小胶质细胞中的MAPK和NF-κB活化可以调节促炎介质的产生。Zhou等[28]发现，银杏内酯和白果内酯可通过调节TLRs/MyD88/NF-κB信号通路抑制OGD/R诱导的BV2 小胶质细胞炎症因子的表达。党亚龙等[29]也发现，罂粟碱抑制小胶质细胞活性是通过cAMP/PKA/CREB和NF-κB通路共同实现的。cAMP能够抑制NF-κB的活化，减少P65/P50的核转移，从而降低NF-κB的活化水平。另外，cAMP/PKA通路活化引起的CREB磷酸化可在细胞核与NF-κB竞争性结合P300及CBP，从而抑制NF-κB通路活性 。此外，激活PKA也能通过直接或间接修饰P65 C末端反式激活，降低NF-κB的活性[30]。

图1 cAMP抑制NF-κB炎症通路

2.2 cAMP促进IL-10转录和表达IL-10是小胶质细胞分泌的重要抗炎介质。蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)和CREB磷酸化后通过GLP-1受体激活，导致M2型小胶质细胞IL-10过表达。既可通过经典的cAMP/PKA/CREB通路介导，也可通过cAMP/PKA/p38/CREB通路介导[25]。并且，磷酸化的CREB还能直接启动IL-10等抗炎因子的转录[31]。

2.3 cAMP降低小胶质细胞的异常吞噬小胶质细胞异常的吞噬功能可导致视网膜神经细胞的再次损伤，升高细胞浆cAMP水平能够通过激活 EPAC 信号显著抑制小胶质细胞的吞噬功能。Makranz等[32]发现，小胶质细胞维持吞噬功能需要正常水平的cAMP，而升高细胞内的cAMP水平可以抑制吞噬功能，如PTX (Gi抑制剂)、ACs激活剂(Forskolin)或磷酸二酯酶抑制剂(IBMX、Rolipram)。他们还发现PKA-EPAC是cAMP抑制小胶质细胞吞噬功能的关键信号通路。

3 磷酸二酯酶抑制剂降低小胶质细胞活化

磷酸二酯酶(phosphodies terase,PDE)抑制剂可以水解cAMP和cGMP，但不同的PDE同工酶家族的特异性不同。具有cGMP水解特异性的是PDE5、PDE6和PDE9，具有cAMP和cGMP水解特异性的是 PDE1、PDE2、PDE3、PDE10、PDE111，而具有cAMP水解特异性的是PDE4、PDE7和PDE8。 其中主要负责水解cAMP的是PDE4[33]。因此，PDE抑制剂可以通过增加细胞内cAMP水平来发挥其抗炎作用，从而抑制小胶质细胞活化。

3.1 选择性PDE抑制剂

3.1.1 PDE1抑制剂尼莫地平：尼莫地平是一种Ⅰ型钙通道阻滞剂，目前临床主要用于蛛网膜下腔出血后的脑血管痉挛、缺血性脑血管病、偏头痛等疾病治疗。Schampel 等[34]发现，尼莫地平可特异性地抑制小胶质细胞活力，促进细胞收缩，甚至凋亡，但其并不是通过阻滞钙通道的途径来发挥作用。尼莫地平还可以降低小胶质细胞的促炎活性及氧化应激反应，但并未杀死所有小胶质细胞，而是在慢性炎症的过程中，减少其数量及其释放的有害物质，同时可促进残存的小胶质细胞吞噬细胞碎片。此外，一种理论认为，高眼压可引起视网膜血管受到挤压，进而导致视网膜血管缺血或破裂出血。Michalk等[35]发现，尼莫地平可增加受损毛细血管的血流量，增加正常眼压性青光眼患者的视盘血流量和脉络膜血流量，并改善颜色对比敏感度[36]。Schampel等[34]研究发现,尼莫地平可以减轻脊髓退行性病变，并且，钙通道细胞特异性地影响小胶质细胞凋亡，而这一作用可被作为钙通道拮抗剂的尼群地平所抑制。另外，Chiozzi 等[37]发现，无论在体内或体外，β-淀粉样蛋白均可刺激小胶质细胞活化、释放IL-10和激活NF-κB，这一作用需要依赖P2X7R受体的表达。而尼莫地平可以抑制这一作用。Hashioka等[38]研究发现，尼群地平对脂多糖(LPS)和干扰素-γ联合诱导的人小胶质细胞和单核细胞的神经毒性分泌也有抑制作用，其对于包括阿尔茨海默病在内的视神经退行性疾病的治疗将是一种有效的方案。Li 等[39]研究发现，尼莫地平对LPS刺激的小胶质细胞产生NO、TNF-α、IL-1β、PGE2起抑制作用，NADPH氧化酶(PHOX)是其作用的关键酶。Maria等[40]发现,含有NMD-CD络合物的尼莫地平滴眼液滴眼，一次用药就可有效降低眼压。Bose等[41]发现，口服尼莫地平钙拮抗剂改善了正常眼压型青光眼患者的对比敏感度。

长春新碱：长春新碱作为一种有效的抗炎药物用于脑血管病的治疗。Zhang等[42]认为,长春新碱可以通过NF-κB通路抑制内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞和小胶质细胞释放炎性因子和趋化因子，从而发挥抗炎作用。

3.1.2 PDE3 抑制剂PDE3对cAMP 具有高亲和力,对cAMP 和cGMP 均有水解作用，且PDE3 对cAMP 的水解速率是cGMP 的10 倍。低剂量的PDE3抑制剂可以有效提高细胞浆内cAMP水平。近年来，PDE3抑制剂用于神经保护的作用已成为研究热点。

奥普力农：奥普力农可有效提高细胞内cAMPiigu水平，促进神经元的存活。Esposito等[43]发现，0.2 mg·kg-1的奥普力农可以有效减轻脊髓挫伤后小鼠胶质细胞的活化，减少TNF-α和IL-1β的表达，从而发挥中枢神经保护作用。

丙戊茶碱：Moraes等[44]研究发现，丙戊茶碱可以通过抑制神经炎症途径预防大鼠经LPS诱发的疾病行为和抑郁样行为。Landry等[45]发现，丙戊茶碱阻断LPS刺激大鼠小胶质细胞亚硝酸盐的释放，抑制LPS刺激大鼠巨噬细胞亚硝酸盐的释放。此外，Mcrae等[46]发现，丙戊茶碱可以减少大鼠脑缺血模型的活化小胶质细胞数量。

依诺昔酮：Beute等[47]发现，依诺昔酮可以减轻HDM小鼠的过敏性炎症，降低嗜酸性粒细胞数量，从而有利于减少过敏性炎症中嗜酸性粒细胞的聚集。此外，依诺昔酮仅需低剂量就具有生物活性，并已在临床上使用超过20年。

3.1.3 PDE4 抑制剂PDE4是水解cAMP的主要酶，PDEB亚家族，特别是PDE4B2，可以调节炎症反应过程中细胞内cAMP水平。

异丁司特：目前主要用来治疗支气管哮喘及中风后的头晕症状。Schwenkgrub等[48]发现，异丁司特剂量依赖性地抑制小胶质细胞和星形胶质细胞活化：通过降低细胞内IL-10、TNF-α和IL-1β的表达，升高IL-6和NO的表达发挥神经保护作用。 Fujita等[49]发现,鞘内单次注射异丁司特(25 μg)可抑制大鼠坐骨神经损伤后7～21 d建立的痛觉超敏状态。重复注射异丁司特(25 μg·kg-1)可减少脊髓中p38磷酸化细胞的数量。Mizuno等[50]研究也证实,异丁司特可以显著抑制由LPS或干扰素-γ激活的小胶质细胞诱导的神经元细胞死亡。异丁司特以剂量依赖的方式抑制NO、活性氧、IL-1β、IL-6和TNF-α产生，并增加IL-10产生，以及其他神经营养因子，包括活化小胶质细胞中的神经生长因子(nerve growth factor，NGF)，胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derived neurotrophic factor,GDNF)和神经营养因子(neurotrophin,NT)。Wakita等[51]在结扎颈总动脉大鼠模型中发现，异丁司特可以计量依赖性地抑制视束、内囊和胼胝体中小胶质细胞的活化及TNF-α的产生。Cueva Vargas等[52]研究发现，在高眼压大鼠模型中，异丁司特眼内给药抑制了视网膜和视神经中的大胶质细胞和小胶质细胞的活化，减少了促炎细胞因子的产生。重要的是，异丁司特在不改变眼压的情况下，促进了RGC胞体存活，防止了轴突变性，并改善了青光眼的顺行轴浆运输。有趣的是，高眼压引发了Müller胶质细胞中PDE4A亚型的上调，而异丁司特则刺激了这些细胞中cAMP的积累。异丁司特的抑制剂RP-cAMP可完全阻断其这种作用。总之，这些研究均表明,异丁司特是一种有效的小胶质细胞调节剂，它可以降低促炎介质水平，并提高RGC的活性。

阿普斯特：阿普斯特是一种口服的PDE4抑制剂，可降低TNF-α及IL-23的表达，并增加IL-10表达，有助于减少银屑病及牛皮癣患者的炎症信号通路的活性[26]。

咯利普兰：Kranz等[53]、Schaal等[54]和Korhonen等[55]的研究发现，咯利普兰可通过升高cAMP水平，活化cAMP-PKA通路及ERK/MAPK通路，诱导CREB的磷酸化，发挥CNS损伤后的抗炎和神经保护作用。尽管已经证实咯利普兰在CNS损伤的实验模型中具有神经保护作用，但尚无相关临床试验的开展。Peng等[56]研究发现，在大鼠蛛网膜下腔出血模型中，腹腔注射咯利普兰10 mg·kg-1后，小胶质细胞的激活、NF-κB的活化被抑制，促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达均降低，保护性细胞因子IL-10的表达升高。此外，神经元细胞死亡明显减少。该作用与调节SiRT1/NF-κB通路有关。同时，促炎细胞因子生成的正反馈循环和免疫激活意味着细胞因子可能不仅是由环腺苷酸调控，还反过来调节环腺苷酸。TNF-α可显著降低cAMP水平，增加cAMP依赖的PDE活性，该作用可被咯利普兰、PKA抑制剂、MEK抑制剂或NF-κB抑制剂所拮抗，提示PDE4、PKA、MEK和NF-κB在此调节中起一定作用[57-58]。此外，Kang等[59]发现,在RGC通过去血清的方法模拟青光眼视神经营养支持减少的实验中，咯利普兰可显著减轻血清剥夺诱导的RGC死亡，细胞内cAMP水平升高，对于抑制青光眼RGC死亡有价值[59]。

罗氟司特：El-Ashmawy等[60]发现，罗氟司特可通过提高细胞内cAMP水平，减轻溃疡性结肠炎大鼠的炎症反应。Santiago等[61]研究还发现，在慢性脑灌注不足衰老大鼠模型中，罗氟司特(0.003 mg·kg-1和0.010 mg ·kg-1)每天1次腹膜内给药，持续29 d后，小胶质细胞中Arg-1基因表达增加。

3.1.4 PDE5 抑制剂西地那非：西地那非是一种口服血管扩张剂，广泛用于治疗勃起功能障碍和肺动脉高压。Moretti等[62]研究表明，西地那非的抗炎作用可能在新生小鼠脑局灶性缺血后期提供神经保护作用，防止病程延长，这一作用可能是通过调节炎症通路(包括小胶质细胞和巨噬细胞过度活化)来预防新生小鼠中枢缺血性病变的进展。Nunes等[63]发现,在饲料中加入质量分数0.2%的铜(CPZ)可诱导小胶质细胞表达胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)，并促进小胶质细胞活化。给予西地那非降低促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达，增加抗炎细胞因子IL-10的表达。此外，给予西地那非可减少 GFAP、IL-1β、TNF-α、总NF-κB水平，并促进小胶质细胞活化。有趣的是，西地那非也降低了NGF水平。西地那非的抗炎和神经保护作用可能是通过调节AMPK-IKβα-NF-κB信号来实现的。此外，Daniela Lucena等[64]研究证明，西地那非可以促进骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)的M2表型转换，并促进这些细胞和EAE小鼠脊髓M2小胶质/巨噬细胞的髓鞘吞噬功能。Zhao等[65]发现，敲除PDE5基因可抑制LPS刺激的小胶质细胞NO和iNOS蛋白表达。此外，作者还观察到NF-κB在转录水平上上调LPS刺激的小胶质细胞中PDE5的表达，而西地那非能抑制NF-PDE B的转录上调。西地那非可以增加小胶质细胞的cGMP水平，而cGMP的类似物8-Br-cGMP下调细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)/NF-κB通路，提示西地那非通过减少PDE5的表达和增加cGMP的水平来抑制小胶质细胞的激活。重要的是，西地那非能显著减轻条件培养液诱导原代小胶质细胞的死亡。Zhao等[66]发现，西地那非浓度依赖性地降低诱导型一氧化氮合酶、IL-1β和TNF-α的表达，显著抑制LPS诱导的小胶质细胞产生NO、IL-1β和TNF-α。此外，西地那非明显抑制LPS诱导的NADPH氧化酶关键催化亚基gp91phox的表达和细胞内活性氧水平的升高。综上所述，这些数据提示，西地那非通过阻断NF-κB和MAPK的激活，在体外对LPS激活的小胶质细胞发挥抗炎作用。更重要的是，在一个随机双盲对照组试验中，Grunwald等[67]发现在最大治疗剂量100 mg时，西地那非对男性慢性开角型青光眼的眼压无明显影响。

3.2 非选择性PDE抑制剂罂粟碱：党亚龙[29]研究发现，罂粟碱可剂量依赖性地抑制LPS诱导小胶质细胞形态学变化、炎症因子转录、TNF-α和IL-1β的释放，还可以促进BV2细胞表型转换及通过NF-κB通路抑制LPS诱导的小胶质细胞活化，但并不逆转LPS诱导的原代视网膜小胶质细胞形态学改变。Zhou等[68]发现，罂粟碱可能通过cAMP/PKA和MEK/ERK通路抑制炎症因子，促进抗炎因子表达，从而抑制LPS诱导的原代视网膜小胶质细胞活化，而MEK/ERK通路可能部分受cAMP/PKA调节，为其保护CNS提供理论依据和实验依据。Lee 等[69]发现，PAP通过调节多种炎症信号抑制LPS刺激的离体和在体小胶质细胞产生一氧化氮和促炎细胞因子。此外，PAP还可提高细胞内cAMP水平和CREB磷酸化水平。PKA抑制剂H89可逆转PAP的抗炎作用，提示PKA信号通路在PAP的抗炎作用中起重要作用[69]。

4 问题与展望

视网膜小胶质细胞的活化在青光眼视神经损伤的过程中发挥了重要的作用。了解小胶质细胞的活化机制可为青光眼下一步治疗的研究提供新思路。目前已有研究表明，提高细胞浆内cAMP水平可以抑制小胶质细胞异常活化，而PDEs抑制剂可以减少cAMP分解，与小胶质细胞的活化密切相关。已知cAMP/PKA/CREB和NF-ΚB通路共同作用抑制小胶质细胞活性，但其下游机制仍不清楚，需要进一步研究。此外，特异性的PDEs抑制剂仍未研发，使用的PDEs的剂量及给药方式也需要进一步研究，这些都是未来需要解决的问题。