小胶质细胞的嘌呤受体在脉络膜新生血管小鼠热损伤模型中的表达△

李璐 刘珏君 许阿敏 陈长征 Nicole ETER

脉络膜新生血管(CNV)的形成是导致许多眼底病患者视力急剧下降的最主要原因。目前，抗血管内皮生长因子(VEGF)药物是治疗CNV的一线方案。但部分患者对抗VEGF药物呈无应答反应。因此，继续探索其他可能抑制或改善CNV的途径依然是亟待解决的现实问题。已有研究证实，小胶质细胞在CNV的发生过程中发挥着重要作用[1-2]。我们前期研究发现，激光诱导小鼠CNV形成后，激光斑附近可见激活的小胶质细胞聚集[3]，并可分泌大量促血管生成物质及炎症因子[4]，但具体机制尚未完全明确。

小胶质细胞作用的发挥与其表面多种受体存在紧密关系[2]。已有研究证实，嘌呤受体(P2)在中枢神经系统的小胶质细胞功能发挥中起至关重要的作用[5]。但在视网膜内，P2受体是否同样影响小胶质细胞的功能并影响CNV的形成，相关报道尚少。因此，本研究通过激光诱导建立小鼠CNV模型，检测局部激活小胶质细胞的P2受体表达情况，并通过抑制P2受体观察小胶质细胞活性的改变及对CNV发生发展的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物选择健康清洁级6～8周C57BL/6J小鼠25只(体质量为18～23 g)，与C57BL/6J小鼠逆代杂交至少10次的CX3CR1GFP/+基因敲除小鼠15只(德国明斯特大学医学院动物中心提供)。所有小鼠均饲养在SPF级屏障系统。动物的饲养与处死遵守美国国立卫生研究院的《实验动物管理及使用指南》。本研究遵循《赫尔辛基宣言》，同时获得武汉大学人民医院及德国明斯特大学医学院动物伦理委员会的批准。

1.1.2 主要试剂与仪器CD11b抗体(MCA711，英国Serotec公司)，P2受体特异性抑制剂磷酸吡哆醛-6-偶氮(苯-2，4-二磺酸)四钠盐水合物(PPADS，sc-202770A)、P2X4抗体(sc-15187)、P2X7抗体(sc-15200)、P2Y2抗体(sc-20124)、P2Y12抗体(sc-27152)(美国Santa Cruz公司)。荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)，共聚焦激光眼底荧光造影仪(德国海德堡公司)，多激光治疗仪(中国科林仪器股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立除正常对照组(5只C57BL/6J小鼠)外，其余小鼠(包括C57BL/6J小鼠和CX3CR1GFP/+小鼠)均建立激光诱导CNV建立动物模型。具体步骤参考文献[4]。

1.2.2 动物分组及干预25只C57BL/6J小鼠随机分为5组，以非激光组作为正常对照组(5只)，剩余小鼠(模型组)在激光后第1天、第4天、第7天及第14天麻醉后处死并摘除眼球，每个时间点各5只。15只CX3CR1GFP/+小鼠随机分为3组，每组各5只，第1组和第2组在造模成功后即在玻璃体内分别注射2 μL PPADS(PPADS注射组)或PBS(PBS对照组)，第3组在造模成功后每天一次PPADS局部滴眼(PPADS眼药组)，共3 d。以玻璃体内注射PBS作为PBS对照组。造模后第4天，CX3CR1GFP/+小鼠先于麻醉散瞳状态下行视网膜自发荧光检测和荧光素眼底血管造影(FFA)检查，之后处死取眼球进行后续检测。

1.2.3 视网膜自发荧光检测和FFA检查麻醉并散瞳后，采用德国海德堡2代视网膜血管显像仪对3组CX3CR1GFP/+小鼠视网膜行自发荧光检测和FFA检查。在自发荧光模式下采集小鼠视网膜图像后将0.2 mL 10 g·L-1荧光素钠注射液注入小鼠腹腔，注射开始计时行FFA检查双眼并于1 s内注射完成。使用30°摄像镜头对准视盘及周围区域获取后极部视网膜图像。为了提高荧光信号的信噪比，使用图像分析软件(Heidelberg Eye Explorer,Heidelberg Engineering)从多幅图像中计算出一幅均值图像。

1.2.4 视网膜冰冻切片及免疫荧光化学染色具体步骤参考文献[4]，将染色后组织切片置于倒置荧光显微镜下照像并保存。

1.2.5 实时荧光定量PCR检测采用实时荧光定量PCR法检测各组小鼠视网膜中P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12受体mRNA含量的变化。依照Trizol试剂盒说明书提取mRNA，使用Easy-Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒逆转录为cDNA，使用PCR仪进行目的基因扩增。引物序列如下：P2X4上游引物：5’-TGTCCCCAGGCTACAATTTC-3’，下游引物：5’-GGCAGCTTTTTCTCCCTTCT-3’，扩增片段长度373 bp；P2X7上游引物：5’-CTTTTGCACCTTGAGCTTCC-3’，下游引物：5’- TCCATGCTAAGGGATTCTGG-3’，扩增片段长度152 bp；P2Y2上游引物：5’-GTGGCCTACAGCTTGGTCAT-3’，下游引物：5’-GCGTGCGGAAGGAGTAGTAG-3’，扩增片段长度235 bp；P2Y12上游引物：5’-AGTGATGCCAAACTGGGAAC-3’，下游引物：5’-TGAATGCCCAGATAACCACA-3’，扩增片段长度208 bp。mRNA的相对表达量使用公式2-ΔΔCt×103计算。将对照组目的基因的相对表达量作为1，各标本重复检测3次后取其平均值。

1.3 数据计算与统计分析采用Adobe Photoshop CS5 (Adobe,San Jose,CA)软件对自发荧光图像中激光斑处小胶质细胞荧光像素强度及FFA图像中CNV处荧光渗漏像素强度进行定量分析。分别通过比较激光斑处小胶质细胞荧光像素强度或CNV处荧光渗漏像素强度与周边正常视网膜处像素强度，计算荧光比，以减少由于不同采集时间点荧光强度差异造成的统计学偏倚。采用SPSS 19.0 统计学软件对数据进行统计分析，所有数据以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，当方差不齐时采用近似F检验。检验水准：α= 0.05。

2 结果

2.1 激光诱导CNV形成后视网膜P2受体的表达

2.1.1 免疫荧光化学染色结果免疫荧光化学染色结果显示，正常视网膜(正常对照组)中静息状态下的小胶质细胞几乎无P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12受体表达，但激光诱导CNV形成后，激光斑附近可见大量目标受体表达，部分荧光与激活的小胶质细胞荧光融合。与正常对照组相比，模型组四种目标受体表达量在激光损伤后第1天即可增加；第4天达峰值；随后下降，第7天时少量激活的小胶质细胞表达目标受体；第14天时，仅有极少量激活的小胶质细胞表达目标受体(图1)。

结合本工程强蚀变岩的物理力学特性、注浆模拟试验成果及工程实践，总结出了一套适合于强蚀变岩TBM洞段的施工方法，其处理工艺流程见图7。主要步骤如下：

2.1.2 激光诱导CNV形成后目标受体mRNA的表达实时荧光定量PCR检测结果显示，激光诱导CNV形成后，与正常对照组相比,模型组小鼠四种受体P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12的mRNA在激光损伤后第1天即显著增加，第4天时达峰值(t=6.05、2.95、3.67、5.98,均为P<0.01)，随后(第7天)渐下降;但在第14天时小幅度增加。与第7天模型组小鼠目标受体P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12的mRNA含量相比，第14天时目标受体mRNA含量小幅度的增量差异均无统计学意义(t=9.59、11.32、9.41、6.97,P=0.057、0.061、0.064、0.072)(图2)。

2.2 PPADS对小胶质细胞和P2受体的抑制作用

2.2.1 PBS对照组、PPADS眼药组和PPADS注射组视网膜免疫荧光化学染色免疫荧光化学染色结果显示，PPADS眼药组和PPADS注射组小胶质细胞P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12受体含量均明显少于PBS对照组(图3)。

2.2.2 PBS对照组、PPADS眼药组及PPADS注射组目标受体mRNA的表达实时荧光定量PCR检测结果显示，与PBS对照组相比，PPADS注射组(t=5.54、9.82、3.86、7.91；均为P<0.01)和PPADS眼药组(t=3.24、5.89、6.75、4.97；均为P<0.01)P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12受体mRNA的含量均明显下降，而PPADS眼药组与PPADS注射组之间差异均无统计学意义(t=6.82、12.32、10.13、8.79,P=0.876、0.793、0.574、0.497)(图4)。

图1 激光诱导CNV形成后不同时间点小胶质细胞(CD11b绿色，左图)P2X4、P2X7、P2Y2、P2Y12受体(红色，右图)的表达 GCL：视网膜神经节细胞层；INL：内核层；ONL：外核层。

图2 激光诱导CNV形成后不同时间点P2受体mRNA表达水平

图3 激光诱导CNV形成后第4天PBS对照组、PPADS眼药组和PPADS注射组小胶质细胞(CD11b绿色，左图)P2受体(红色，右图)的表达 GCL：视网膜神经节细胞层；INL：内核层；ONL：外核层。

图4 激光诱导CNV形成后第4天PPADS眼药组、PPADS注射组和PBS对照组P2受体mRNA表达水平

2.2.3 PBS对照组、PPADS眼药组及PPADS注射组视网膜自发荧光检测视网膜小胶质细胞自发荧光检测结果显示，PBS对照组、PPADS注射组、PPADS眼药组荧光比分别为4.54±1.22、1.99±0.62、2.74±0.84。与PBS对照组相比，PPADS眼药组与PPADS注射组的小胶质细胞自发荧光强度均明显减弱(均为P<0.001)；PPADS注射组与PPADS眼药组相比，PPADS注射组小胶质细胞的自发荧光强度降低更为显著(P<0.001)(图5)。

2.2.4 PBS对照组、PPADS眼药组及PPADS注射组视网膜FFA检查结果FFA检查结果显示，PBS对照组、PPADS注射组、PPADS眼药组CNV渗漏荧光比为分别2.38±1.35、1.55±0.54、1.45±0.72。与PBS对照组相比，PPADS眼药组与PPADS注射组的CNV荧光渗漏强度均明显减弱(均为P<0.001)；但PPADS眼药组与PPADS注射组之间，CNV荧光渗漏强度差异无统计学意义(P=0.864)(图6)。

图5 PBS对照组(A)、PPADS眼药组(B)及PPADS注射组(C)内小鼠视网膜小胶质细胞自发荧光以及三组间小胶质细胞自发荧光的荧光比差异(D)

图6 PBS对照组(A)、PPADS眼药组(B)及PPADS注射组(C)内小鼠视网膜FFA显示CNV处荧光渗漏以及三组间CNV荧光比差异(D)

3 讨论

P2X4和P2X7受体已被证实在中枢神经系统中参与调节神经传递并加强突触生理功能，调节免疫并协调炎症反应[8-9]，但在眼部，是否参与视网膜疾病发生发展的相关研究尚少。Gu等[10]研究显示，在AMD患者中，P2X4 Tyr315Cys的基因变异率较同年龄正常对照组高2倍以上，P2X7 Gly150Arg的基因变异率也远超正常对照组。在灵长类动物眼部，正常情况下，P2X4和P2X7受体可作为视网膜中的清道夫受体，清除视网膜下的代谢沉积物，一旦被异常激活，它们会引起生理性吞噬功能的丧失，使个体增加罹患AMD的风险[10]。P2Y2和P2Y12是否参与CNV的发生发展过程，相关报道尚少。本研究结果发现，在正常小鼠视网膜中，几乎无激活的P2受体(P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12)表达，但在激光诱导CNV形成后，P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12四种受体均可激活，在CNV形成后第1天，四种受体含量即可明显增加，至第4天时达峰值，随后渐下降，且在激光损伤后早期(第1天和第4天)，大量P2受体(尤其是P2X4、P2X7和P2Y12)的荧光与小胶质细胞荧光重合，提示CNV处激活的小胶质细胞可表达P2受体。激光诱导CNV形成后期(第14天)，目标受体含量的下降也可能与表达小胶质细胞激活量的下降有关[4]。

PPADS是P2受体特异性拮抗剂[11]。Birke等[12]研究结果显示，在激光诱导CNV形成小鼠模型中，连续3 d PPADS滴眼可缩小CNV渗漏范围，并减少血管内皮细胞的迁移。他们认为该治疗作用是因为PPADS可抑制补体的激活以及膜攻击复合物的形成。本研究结果发现，通过两种不同方式(玻璃体内注射和局部滴眼)，PPADS均可显著减少激光斑附近激活小胶质细胞的数量和激光诱导生成的CNV的荧光渗漏。我们认为，其可能原因为PPADS可通过抑制小胶质细胞表面的P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12受体从而影响小胶质细胞的功能，进一步影响小胶质细胞在CNV发生发展中的作用[2，4]，减少CNV的渗漏。

本研究中PPADS注射组和PPADS眼药组采用玻璃体内注射和局部滴眼两种干预方式，抑制结果评价以PPADS注射组为主。初步探索PPADS局部滴眼方式也可达到抑制小胶质细胞活性和CNV渗漏的效果，但抑制效果不及玻璃体内注射方式。后续仍需进一步参考药物通透性设置不同药物浓度组以及对照组，研究不同干预方式的具体抑制效果差异，为无创性治疗方式提供可能的实验依据。

本研究采用CD11b作为小胶质细胞的标记物，虽然CD11b除小胶质细胞外，同时可不同程度地标记巨噬细胞、嗜中性粒细胞及树突状细胞，但我们前期研究已证实，在激光诱导小鼠CNV形成模型中，激光斑附近激活聚集的CD11b+细胞以小胶质细胞为主[3]。本研究初步证实了激光诱导CNV形成后，小鼠视网膜内激活的小胶质细胞可表达P2X4、P2X7、P2Y2和P2Y12受体，且表达量在激光损伤后第4天达最大值。P2受体抑制剂PPADS在抑制P2受体后，可进一步影响小胶质细胞的功能，同时减少CNV的渗漏。但本研究仍有以下缺陷：(1)激光诱导CNV模型仅是模拟临床急性损伤导致CNV形成模型的一种，不能完全比拟临床上其他原因，如慢性缺血缺氧等，导致CNV形成的过程，因此以上实验结论是否在其他CNV模型中同样成立有待进一步研究。(2)该实验尚未深入探讨PPADS对CNV抑制作用的具体机制，P2受体及其抑制剂是通过何种信号通路影响CNV的发生发展，且PPADS能否成为临床防治CNV的新方向，将是我们继续研究的重点。