不同植物生长调节剂对白及种子萌发及生长影响研究

赵 垚，曹小勇，秦公伟，高 尚，胡选萍，蒋景龙

(陕西理工大学 生物科学与工程学院 陕西省资源生物重点实验室， 陕西 汉中 723000)

白及(Bletillastriata)为兰科白及属的多年生宿根草本植物，其花大色艳，且有肥厚肉质的可供药用的块茎[1]，具有收敛止血、消肿生肌等功效，用于治疗咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等症状。白及不仅药用价值高，而且具有较高的观赏价值[2]，是我国现代医药工业[3]和化妆品工业的重要原材料[4]。白及属约有6种，主要分布于亚洲的缅甸北部、中国至日本。中国产有4种，分别为华白及(Bletillasinensis)、小白及(Bletillaformosana)、白及(Bletillastriata)和黄花白及(Bletillaochracea)。主产于贵州、四川、湖南等地区[2]。

兰科种子极其微小，种皮内仅有1个发育不完全的胚，没有胚乳和子叶，只有脂滴和少量蛋白质，缺乏萌发过程中所需要的后备营养，自然条件下萌发率极低。植物激素在兰科植物组织培养诱导原球茎的过程中起到重要作用，是兰科植物成苗的关键因素，也是影响种子发芽的重要因子[5]。目前的研究显示白及种子可以在液体培养基中萌发形成原球茎，原球茎通过播种在干净介质上快速形成实生苗。代建丽等[6]以白及蒴果为材料，应用涂布法接种白及种子，研究植物激素对种子无菌萌发的影响，得出6-BA是影响种子萌发的主要因素，而赤霉素对种子的影响不明显。张燕等[7]研究表明，1.0 mg/L NAA适合种子萌发，0.1mg/L 6-BA和NAA组合会降低种子萌发率。郄亚微[8]在MS、1/2 MS添加6-BA的培养基上进行无菌播种，得出种子最佳培养基为1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA，它能有效提高萌发率，促进原球茎的生长；无性繁殖最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。王楷等[9]研究表明，1.0 mg/L 6-BA适合白及种子萌发。赵漫丽等[10]研究表明，2.0 mg/L 6-BA以下浓度的和1.0 mg/L NAA组合促进种子萌发。但白及种子在液体培养基中添加不同激素对其无菌萌发的影响，目前尚没有深入研究报道。本试验探求不同浓度的6-BA、NAA、ABA、GA3对白及种子萌发的影响，在不同浓度液体激素培养基中培养白及种子，确定种子在离体萌发过程中激素对其影响，为白及种子萌发液体培养基优化及其他种类兰科植物种子萌发积累资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白及蒴果采自陕西省汉中市留坝县(N33°37.516′，E106°54.958′，海拔(972.2±6.2) m)白及栽培基地，采摘后放入牛皮纸袋，5 ℃冷藏待用。

1.2 白及种子在不同培养基质中培养

选取未开裂蒴果用体积分数75%酒精处理60 s，体积分数10%的NaClO溶液处理20 min后，用无菌水冲洗3次。无菌条件下剥去果皮，以1/2 MS为基本培养基，将约100粒种子分别接入浓度梯度为0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L的6-BA、NAA、ABA、GA3液体培养基中，1/2 MS液体培养基为空白对照组，每种培养基重复5瓶。

1.3 培养条件与观察统计

培养温度(25±2)℃，光照强度2500～3000 lx，光照时间12 h/d，静置培养。用Leica M205C体视显微镜连续观察，在15、30、50 d拍照记录白及种子发育过程，分别取至少20个样本进行测量，重复3次统计原球茎直径、叶片长度和萌发率等。当种子内的种胚大于种皮直径，不论胚是否突破种皮，全视为萌发，计算公式：萌发率=(萌发种子数/有胚种子数)×100%；实验结果用Digimizer进行数据测量，GraphPad Prism 5.01进行数据整理分析，相同培养天数不同浓度之间采用Tukey检验对数据进行差异显著性分析，显著水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 白及种子萌发及生长过程

白及种子细小呈纺锤形，种胚呈淡黄色，对照组不加任何激素，培养3 d后种胚转变为淡绿色，7 d后绝大多数种胚变绿、突破种皮并在原球茎基部出现少量假根；15 d时统计萌发率为100%，原球茎呈绿色，平均直径达(0.30±0.07) mm，其顶端生长锥逐步发育形成叶原基，平均长度(0.11±0.08) mm；培养至30 d，原球茎增长迅速，直径达(1.17±0.24) mm，但叶片生长较缓，平均长度(0.43±0.31) mm；培养至50 d，原球茎持续增大，直径为(1.33±0.20) mm，叶片长(0.63±0.52) mm。

2.2 6-BA对白及种子萌发及生长的影响

添加不同浓度6-BA后，萌发率平均可达98%，培养15 d时仅在高浓度中有少量未萌发，后期培养中均萌发，与对照组无显著差异(见图1)。在原球茎生长早期(15 d)1.0 mg/L 6-BA开始出现显著抑制，2.0 mg/L 6-BA中原球茎长势较差，发育延缓，叶片平均长度仅(0.04±0.04) mm；培养30 d和50 d，在0.1～1.0 mg/L 6-BA中表现出对原球茎生长的促进作用，叶片生长表现出浓度越高越受抑制，高浓度中原球茎和叶片生长缓慢，但从分析来看原球茎直径和叶片长度与对照组无显著性差异。

(a) 原球茎生长情况 (b) 叶片生长情况图1 添加不同浓度6-BA后不同培养时间白及原球茎和叶片生长情况

2.3 NAA对白及种子萌发及生长的影响

添加不同浓度NAA进行培养，萌发率可达100%，与对照组无差异。主要出现原球茎绿色消退，由绿变黄甚至接近“白化”现象，浓度越高褪色现象越明显，但种子萌发和叶片转绿生长正常。培养15 d时，0.1 mg/L NAA开始出现原球茎绿色变为黄绿色现象，2.0 mg/L NAA中原球茎已完全呈半透明状，且生长状态差；培养至30 d时“白化”现象逐渐变弱，半透明状态不明显；培养50 d时大于0.1 mg/L NAA原球茎生长越受抑制，浓度越高抑制作用越显著，叶片生长情况类似，高浓度显著抑制叶片生长(图2)。

(a) 原球茎生长情况 (b) 叶片生长情况图2 添加不同浓度NAA后不同培养时间白及原球茎和叶片生长情况

2.4 ABA对白及种子萌发及生长的影响

添加ABA后均表现出对白及种子萌发和原球茎生长的抑制作用，浓度越大抑制萌发及生长越明显，但原球茎转绿未受抑制。培养至15 d时，0.1 mg/L ABA中萌发率为100%，原球茎变绿，但生长受抑制，0.5 mg/L ABA开始出现显著抑制萌发及生长现象，原球茎呈浅黄色，萌发率为75%，高浓度中萌发率仅40%(图3)；培养至30 d时，与对照组相比添加ABA后白及种子发育情况较差，0.5 mg/L ABA原球茎呈绿色，但其生长受抑制，1.0 mg/L ABA中原球茎呈浅绿色，2.0 mg/L ABA中为浅黄色，后期发育逐渐变绿。培养后期不论是原球茎直径还是叶片长度均表现出0.1 mg/L ABA与对照组差异不显著，其余浓度越高抑制作用越明显(见图4)。不同浓度的ABA对白及种子的萌发及原球茎生长变化统计见表1。

(a) 对照组 (b) 0.1 mg/L ABA (c) 0.5 mg/L ABA图3 培养15 d白及生长情况

(a) 原球茎生长情况 (b) 叶片生长情况图4 添加不同浓度ABA后不同培养时间白及原球茎和叶片生长情况

表1 添加不同浓度ABA后不同培养天数白及萌发率和原球茎生长情况

2.5 GA3对白及种子萌发及生长的影响

添加不同浓度GA3后，平均萌发率95%，与对照组无明显差异，主要表现出对原球茎和叶的伸长作用，但个体之间差异较大(见图5、图6)。原球茎直径在不同培养时间，仅低浓度0.1 mg/L GA3中原球茎与对照组无显著差异，其余浓度表现出差异显著性(图5(a))，原球茎明显伸长，呈浅绿色。培养至30 d时，对照组原球茎平均长度(0.90±0.29) mm，0.5 mg/L GA3中原球茎平均长度可达(1.78±0.78) mm，且伸长部分呈透明状，随着浓度升高，伸长现象越明显；50 d时原球茎平均长度(3.23±1.38) mm，但高浓度2.0 mg/L GA3中白及伸长不明显且生长受抑制(图5(b))。

(a) 原球茎直径生长情况 (b) 原球茎长度生长情况图5 添加不同浓度GA3后不同培养时间白及原球茎生长情况

图6 添加不同浓度GA3后不同培养时间白及叶片生长情况

白及种子在添加不同浓度6-BA、NAA、ABA、GA3上萌发生长结果与空白对照组相比，仅添加ABA后表现出萌发率的差异，高浓度中萌发率仅为40%，显著抑制了种子萌发,其他3种植物激素中萌发率无显著差异。添加4种植物生长调节剂均表现出高浓度原球茎生长受抑制。添加6-BA后原球茎直径和叶片生长与对照组无显著差异(图7(b))；添加NAA后在白及种子萌发早期使原球茎绿色褪变为黄绿色甚至出现半透明状(图7(c))，后期这种现象逐渐变弱；在ABA环境下的白及种子萌发延缓，浓度越高萌发受抑制越明显，但并不抑制原球茎转绿生长(图7(d))；添加GA3后白及种子生长过程中出现了显著促进原球茎和叶的伸长(图7(e))，但在所有培养中仅添加GA3后表现出个体之间差异大。

(a) 对照组 (b) 6-BA (c) NAA (d) ABA (e) GA3。 图7 培养30 d对照组和4种植物生长调节剂(1.0 mg/L)中白及生长情况

3 结论与讨论

白及作为兰科植物中的一员，自然条件下萌发困难，其成熟的种子呈橄榄形，种皮为单层细胞组成[11]。种子的萌发和休眠受多种因素控制，包括植物激素[12]和一些化感物质[13]，如兰科植物天麻种子需要有共生菌的参与才能萌发。Dimalla[14]表明在外源细胞分裂素存在下，通过更有效地利用脂质，可以促进兰花种子的萌发。外源细胞分裂素处理增加了许多兰花的共生萌发，de Pauw[15]发现在低浓度BA的存在下，白杓兰(Cypripediumcandidum)的发芽率增加，而更高的浓度则不会增加发芽率。Miyoshi等[16-17]、Stewart等[18]报道的几种陆地兰花添加外源细胞分裂素后萌发水平都有所提高，他们发现低细胞分裂素水平比高细胞分裂素水平更能促进兰花种子萌发。这与我们的试验结果一致，添加6-BA后在0.1 mg/L～1.0 mg/L中表现出对原球茎生长的促进作用，而高浓度2.0 mg/L中原球茎生长受抑制。郄亚微[8]的实验表明6-BA促进白及种子的萌发，而此次试验结果显示大于1.0 mg/L 6-BA抑制白及原球茎生长，且浓度越高叶片生长受阻，这可能是由于白及种子生长环境不同、发育模式不同，从而影响了对种子萌发的作用。生长素特别是在胁迫条件下能够刺激乙烯发生，进而刺激许多植物种子萌发[19]，Miyoshi等[16]报道了在不同浓度的BA和NAA的作用下，虾脊兰(Calanthediscolor)的萌发率相似，但是当在高浓度的NAA中培养时，更能促进原球茎的发育。Pedroza-Manrique[20]报道了在生长素存在下，粉花凹唇兰(Comarettiafalcata)的萌发减少。而本次试验结果表明高浓度2.0 mg/L NAA抑制白及原球茎的生长，浓度越高抑制作用越显著，添加NAA主要是对原球茎绿色消褪产生影响。

LEE等[21]在研究三棱虾脊兰(Calanthetricarinata)内源性脱落酸浓度和非共生种子萌发的发育变化中发现，兰花种子中高浓度的内源ABA可能在阻止胚胎生长和防止种子发芽中起关键作用。其次，在研究南瓜、黄瓜等其他植株中同样发现ABA能够抑制叶绿素的形成[22-23]，脱落酸(ABA)比茉莉酸甲酯(MJ)更有效地抑制生长和叶绿素的产生[24]，脱落酸抑制叶绿体膜系统的发育，抑制叶绿素的合成[25]。本次试验我们同样发现ABA的确会抑制白及种子的萌发和原球茎的生长，但并不会抑制原球茎变绿生长，在添加ABA后，白及种子生长延缓，但种子萌发后原球茎转绿生长并不受抑制，可能意味着其光合作用未受影响，叶绿素合成也未受阻，只是延迟了白及的萌发和生长。

尽管GA常常会促进许多植物的种子发芽，但发现对兰科的影响结果却不尽相同。Kauth等[26]表明BA、TDZ和KT常促进兰科种子萌发，GA也促进许多植物的种子萌发，但在兰花种子萌发中的应用还不是很成功[27]，GA3浓度可能过高，不能促进种子萌发，但对促进幼苗发育是最佳的。Miyoshi等[16]的结果表明，GA3不能促进C.discolor的种子萌发，但确实促进了蝴蝶兰的幼苗发育[28]。本试验结果发现GA3不影响白及种子萌发，但对白及原球茎和叶片的伸长有明显促进作用，但个体之间差异较大。

Johnson[29]利用离体培养对佛罗里达的濒危兰科植物紫兰种子萌发和籽苗早期发育进行研究，包括GA3、ABA、赤霉素合成抑制剂多效唑(paclobutrazol)和矮壮素(chlormequat)对种子萌发及早期籽苗发育影响，结果显示赤霉素和脱落酸对种子萌发及早期籽苗发育都显示抑制效果，脱落酸的抑制效果是可预见的，而赤霉素则令人意外，因为赤霉素通常有促进种子萌发、降低种子休眠作用，本研究也同样发现高浓度GA3抑制白及生长。Pedroza-Manrique等[20]采用MS基本培养基，测试了IAA、KT和GA33种生长物质对兰科植物C.falcata的种子萌发作用，其中IAA显著降低了种子的萌发，在KT和GA3的组合中，对种子萌发率和幼苗发育具有协同作用。李雨晴[30]研究发现，6-BA对白及种子发芽的促进作用比NAA强；生长素和细胞分裂素在种子萌发过程中起着非常重要的作用，尤其是细胞分裂素的作用更为明显[31-32]。本试验中同样发现，6-BA对白及种子原球茎的生长促进作用较NAA更为明显。此外，郭顺星，郭顺星等[33]表明白及种子在纯水中或灭菌树叶上能正常萌发，与本试验结果类似，证明白及种胚具有萌发所需的贮存物质。

本次试验结果表明采用1/2 MS液体培养基培养白及种子，首先种胚吸水膨大突破种皮，原球茎转为绿色随之长叶，未出现明显真根，这与其在固体培养基质中的发育模式不同，在后期培养过程中极少个体出现真根，此现象可能是其未完全浸在水中，贴壁接触到较多空气所致。综上所述，白及种子在适宜温度、适宜光照等条件下，不添加外源激素均可正常萌发。其他植物生长物质或组合对其萌发的影响还需进一步进行验证。