星点设计-响应面法优化番茄红素纳米结构脂质载体的制备

马永强，修伟业，黎晨晨，王艺錡，陈俊杰

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076）

番茄红素是一种具有功能性的类胡萝卜素，是由规则的头尾结合连接8 个异戊二烯单元组成的四萜化合物[1]，具有抗氧化[2]、保护心血管系统[3]、降血糖[4]等功能。人体和动物体内番茄红素不能自身合成，均需从通过食物摄取。番茄红素广泛存在于西红柿、胡萝卜、番石榴、葡萄柚、番木瓜等果蔬中，食品中的番茄红素主要以全反式的形式存在[1]。由于番茄红素在人体中吸收利用率较低[5]，在食品工业应用上存在困难。随着科学技术的发展，已出现异构化[6]、包埋[7-8]等技术用以提高番茄红素稳定性并提高其生物利用率。

纳米脂质载体系统是将脂质等作为壁材，包埋生物活性物质，采用纳米脂质载体系统处理的生物活性物质具有更高的生物学功能活性。纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carrier，NLC）被称为第二代纳米脂质载体系统[9]，其壁材脂质是将其中一部分固体脂质由液体脂质或液体脂质混合物代替，以输送难溶的生物活性物质，提高稳定性及活性物质的生物利用率。纳米结构脂质载体制备方式主要有乳液-溶剂蒸发法[10]、超临界CO2法[11]、高剪切均质法[12]、薄膜蒸发法[13]、超声法[14]、乙醇注入法[15]等方法。乙醇注入法是将无水乙醇溶解的含活性物质有机相溶液通过注射器注入水相，形成纳米结构脂质载体的方法，其创新点在于有机试剂应用少，且实验中不引入有毒化学试剂。此外，此法适用于热稳定性较差的活性物质，具有热敏性药物适应性较强等特点，与探头式超声法联合后可减小纳米结构脂质载体粒径并使粒径分布均一。

采用乙醇注入-探头式超声法联合制备番茄红素纳米结构脂质载体（lycopene-NLC，Lyco-NLC），以提高番茄红素的稳定性及利用率。实验以Lyco-NLC包封率及粒径为指标，通过单因素试验及星点设计-响应面法优化番茄红素纳米结构脂质载体制备工艺，并对采用优化条件制备的Lyco-NLC进行表征，为番茄红素系列功能产品开发提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

番茄红素为市售。

番茄红素标准品 上海保藏生物技术中心；大豆卵磷脂 广州海莎生物科技有限公司；胆固醇 北京博奥拓达科技有限公司；中链甘油三酯（medium chain triglyceride，MCT） 广东永晟工贸有限公司；正己烷、无水乙醇（分析纯） 天津市富宇精细化工有限公司；Tween 20、Tween-80 广东润华化工有限公司。

1.2 仪器与设备

FA1104B电子分析天平 上海越平科学仪器有限公司；HWS-25电热恒温水浴锅 上海一博科学仪器有限公司；EMS 18A磁力搅拌器 上海隆拓仪器设备有限公司；JY92-IIN超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；TG16-WS台式离心机 湖南湘仪仪器有限公司；UV-5200紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司；Nano-ZS90激光粒度仪 英国马尔文仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Lyco-NLC的制备

准确称取10 mg番茄红素和一定量的大豆卵磷脂、MCT、胆固醇、Tween 20、Tween-80，充分溶于20 mL无水乙醇中，将混合溶液注入100 mL磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L），不断搅拌至乙醇完全挥发（即无明显乙醇气味）后50 ℃水化保温一段时间（即水化时间），通过超声波细胞粉碎机将水化后溶液探头超声处理，过0.45 μm微孔滤膜，4 ℃静置过夜，得Lyco-NLC混悬液。

1.3.2 单因素试验

选取液体脂质大豆卵磷脂、MCT（1∶1，m/m）为复合液体脂质，Tween 20、Tween-80（1∶1，m/m）为复合乳化剂，调整水化时间（15、30、45、60、75 min）、超声时间（0、3、6、9、12 min）、超声功率（98、163、228、293、358 W）、番茄红素与复合液体脂质比（即药脂比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，m/m）、胆固醇与复合液体脂质比（即固液脂质比1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，m/m）、磷酸盐缓冲液pH值（6.2、6.5、6.8、7.1、7.4）的条件下进行单因素试验，各因素固定时的取值为：水化时间45 min、超声时间6 min、超声功率228 W、药脂比1∶40、固液脂质比1∶6、磷酸盐缓冲液pH 6.8，考察其对番茄红素纳米脂质载体包封率及粒径（即平均粒径，下同）的影响。

1.3.3 星点设计-响应面优化试验

根据单因素试验和正交试验（未列出）结果，选取水化时间（A）、超声功率（B）和超声时间（C）为自变量，以番茄红素纳米脂质载体包封率（Y）为因变量，采用星点设计-响应面法优化设计试验，因素及水平编码如表1所示。

表1 星点设计因素与水平Table 1 Factors and levels used for central composite design

1.3.4 包封率及载药量测定

番茄红素标准曲线的绘制：精密称取10 mg番茄红素标准品，溶解于正己烷并定容至100 mL，得番茄红素标准储备液，准确移取一定量番茄红素标准储备液分别制备质量浓度为1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6 μg/mL番茄红素标准溶液，于474 nm波长处测定吸光度，以番茄红素质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，平行测定3 次，绘制标准曲线。得到线性回归方程：y＝0.296 4x-0.058 7，R2＝0.995 1。

包封率及载药量的测定参考Zardini等[16]的方法，采用离心-萃取法测定Lyco-NLC包封率并做适当优化，将适量正己烷加入Lyco-NLC中，2 500 r/min离心4 min，离心3 次，取上层含游离番茄红素的正己烷溶液于474 nm波长处测定吸光度，并根据标准曲线计算游离的番茄红素质量m游，按公式（1）、（2）分别计算包封率及载药量。

式中：m总为制备Lyco-NLC时加入番茄红素总质量/g；m游为制备Lyco-NLC后游离的番茄红素质量/g；m脂质为制备Lyco-NLC时添加的所有脂质（包括复合液体脂质和固体脂质胆固醇）总质量/g。

1.3.5 验证实验和稳定性实验

根据Design-Expert 10.0.4软件分析Lyco-NLC制备的最佳工艺条件，并在最佳工艺条件下制备Lyco-NLC，测定其包封率、粒径、多分散指数及Zeta-电位；将Lyco-NLC于4 ℃条件下分别贮存1、3、7、15、30 d，测定其包封率、粒径、多分散指数及Zeta-电位。

1.3.6 粒径、多分散指数及Zeta-电位的测定

将稀释后的Lyco-NLC样品于25 ℃条件下，采用Nano-ZS90型激光粒度仪测定粒径、多分散指数及Zeta-电位。

1.4 数据处理与分析

所有实验进行3 次平行处理，采用SPSS 22.0软件对数据进行处理，结果以平均值±标准差表示，采用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 水化时间对番茄红素纳米结构脂质载体的影响

图1 不同水化时间对Lyco-NLC包封率和粒径的影响Fig.1 Effect of hydration time on the encapsulation efficiency and particle size of Lyco-NLC

水化时间对Lyco-NLC包封率及粒径的影响实验结果如图1所示，随样品水化时间延长，Lyco-NLC包封率呈增加的趋势。水化时间对Lyco-NLC粒径变化影响明显，15～30 min时粒径随水化时间的延长而减小，30 min达到最低值后粒径增加，可能的原因是：在水化过程中，适当的水化时间有助于壁材闭合形成含番茄红素的纳米结构脂质载体囊泡，超过最适水化时间后壁材可能氧化或因黏度较大而聚积粒径增加。此结果同聂华等[17]采用乙醇注入法制备靶向载紫杉醇脂质体结果类似。选择水化时间45～75 min进行响应面优化。

2.1.2 超声时间对番茄红素纳米结构脂质载体的影响

图2 不同超声时间对Lyco-NLC包封率和粒径的影响Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on the encapsulation efficiency and particle size of Lyco-NLC

超声时间对Lyco-NLC包封率及粒径的影响结果如图2所示，经超声处理后，番茄红素纳米脂质载体颗粒粒径明显减小，原因是超声的振荡作用使粒径降低，同时随超声处理时间的延长，纳米脂质载体的包封率在9 min前呈现增加的趋势，9 min时达到最大值，超过9 min后包封率下降。可能的原因是当超声时间过长，脂膜被破坏，部分纳米脂质载体颗粒破裂，包裹在其中的番茄红素渗漏，包封率降低。王诗琪等[18]在采用逆向蒸发法方法制备莲藕多酚与多糖复合脂质体及熊伟等[19]采用薄膜超声法制备二氢杨梅素脂质体时，同样得出随超声时间延长，脂质体包封率呈现先增加后下降的趋势。选择超声时间6～12 min进行响应面优化。

2.1.3 超声功率对番茄红素纳米结构脂质载体的影响

图3 不同超声功率对Lyco-NLC包封率和粒径的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on the encapsulation efficiency and particle size of Lyco-NLC

不同超声功率对Lyco-NLC包封率及粒径的影响实验结果如图3所示，随超声功率的增加，纳米脂质载体的包封率在228 W前呈增加的趋势，在228 W时达到最大值，之后包封率下降。纳米脂质载体的粒径随超声功率的增加先降低后增加，可能的原因是适当的超声功率由于其振动作用可促进芯材包封，同时其产生的剪切力可适当降低纳米脂质载体颗粒的粒径；但超声功率过大时，纳米脂质载体结构破坏，芯材泄漏，包封率降低；同时颗粒相互黏附聚集，导致粒径变大。吕方方等[20]在制备以羧甲基壳聚糖为壁材、椰油为芯材的脂质体时，通过实验证明适当超声功率可使脂质体包封率增加。选择超声功率228～358 W进行响应面优化。

2.1.4 药脂比对番茄红素纳米结构脂质载体的影响

图4 不同药脂比对Lyco-NLC包封率和粒径的影响Fig.4 Effects of drug-to-lipid ratio on the encapsulation efficiency and particle size of Lyco-NLC

药脂比对Lyco-NLC包封率及粒径的影响结果如图4所示，随脂质添加量的增加，粒径逐渐减小，而包封率呈先增加后降低的趋势，在药脂比为1∶40时包封率达到最大，可能的原因随着脂质含量的增加，芯材被包裹的强度增大，导致包封率增加；但脂质过多无法形成适宜刚性的Lyco-NLC，芯材药物渗漏现象逐渐明显，导致在脂质含量进一步增加时包封率降低[21]。选择最佳药脂比为1∶36（正交试验得出），宁双成等[22]在制备斑蝥素纳米结构脂质载体时得到随着体系脂质含量增加，纳米结构脂质载体包封率呈先增加后降低的结果。

2.1.5 固液脂质比对番茄红素纳米结构脂质载体的影响

图5 不同固液脂质比对Lyco-NLC包封率和粒径的影响Fig.5 Effect of solid-to-liquid lipid ratio on the encapsulation efficiency and particle size of Lyco-NLC

不同固液脂质比对Lyco-NLC包封率及粒径的影响实验结果如图5所示，随液体脂质添加量的增加，包封率先增加后降低，原因是当液体脂质比较少时，纳米结构脂质载体刚性较强，不能起到良好包封芯材药物的作用，随着液体脂质添加量增加，颗粒刚性减小，黏度增加，包封芯材药物能力提升，包封率呈上升趋势，但过量的液体脂质导致粒径刚性不足以支撑粒径结构，壁材破裂芯材渗漏，包封率降低。粒径在固液脂质比为1∶2～1∶8时维持稳定，在固液脂质比为1∶10时增加至196.7 nm，可见液体脂质黏度增加，颗粒相互附着聚集，使粒径增加。故选择最佳固液脂质比为1∶6。闫丹等[23]制备积雪草总苷脂质体时，随着卵磷脂与胆固醇质量比的增加，积雪草苷与羟基积雪草苷的包封率先增大后减小。

2.1.6 pH值对番茄红素纳米结构脂质载体的影响

图6 不同pH值对Lyco-NLC包封率和粒径的影响Fig.6 Effect of pH on the encapsulation efficiency and particle size of Lyco-NLC

磷酸盐缓冲液pH值对Lyco-NLC包封率及粒径的影响结果如图6所示，pH值在6.2～6.8区间包封率逐渐增加，在pH 6.8时达到峰值，之后包封率降低，粒径在pH值为6.2～7.1区间逐渐降低，在pH 7.1时达到粒径最低值后再增加，故选择磷酸盐缓冲液最佳pH值为6.8。潘翠珊等[24]在优化人参皂苷Rg3脂质体处方时得到相似的结果。

2.2 星点设计-响应面法试验结果

表2 星点设计-响应面法试验结果Table 2 Central composite design with experimental results

根据单因素试验和正交试验结果，得到最佳药脂比1∶36、固液脂质比1∶6、磷酸盐缓冲液pH 6.8，再选取水化时间、超声功率、超声时间三因素进行星点设计-响应面法设计，结果见表2，对表2中数据进行多元二次回归拟合，得回归方程：Y＝-324.72+2.33A+1.28B+34.79C-0.001AB+8.72AC-0.054BC-0.018A2-0.001B2-1.07C2。

表3 回归方程的方差分析结果Table 3 Analysis of variance of regression model

采用单因素方差分析进行显著性检验及方差分析，由表3可知，通过方差分析及显著性分析，B、BC、A2、B2、C2项对实验结果影响极显著（P＜0.01），C项P值为0.038 6（0.01＜P＜0.05），对实验结果影响显著，模型对实验结果影响极显著（P＜0.01），失拟项P值为0.673 1，对实验影响不显著（P＞0.01），说明该模型对实验实测值拟合效果好，模型的决定系数R2值为0.966 5，为增加模型预测的可靠性，适当修正后的R2Adj值为0.936 3，证明响应值的总变量仅有6.37%不能用此模型表示[25-26]，证明该模型可用于拟合实验自变量与响应值之间的关系。

图7 两因素交互作用对包封率影响的等高线与曲面图Fig.7 Contour and response surface plots showing the interactive effect of variables on encapsulation efficiency

为更直观考察水化时间、超声功率、超声时间交互作用对Lyco-NLC包封率的影响，分析任意两因素交互作用对Lyco-NLC包封率的影响。如图7所示，水化时间、超声功率、超声时间任意两因素交互时，随因素水平逐渐增加Lyco-NLC包封率均呈现先增加后减少的趋势，当超声功率与超声时间交互时，等高线呈椭圆形，响应面坡度陡峭，表明超声时间与超声功率对包封率影响显著[27-29]。

2.3 验证实验结果

根据Design-Expert 10.0.4软件分析结果，Lyco-NLC制备的最佳参考工艺条件为水化时间61.1 min、超声时间9.8 min、超声功率268.6 W，此时包封率预测值为88.8%。根据参考工艺条件并考虑实际可操作性，调整工艺条件为水化时间61 min、超声时间10 min、超声功率266.5 W，结果表明所制得的Lyco-NLC表观为粉红色悬浊液，证明番茄红素成功包封于壁材内，其包封率为（90.84±0.41）%，载药量为（2.56±0.01）%，粒径分布如图8所示，粒径为（126.48±3.87）nm，多分散指数为0.188±0.028，Zeta-电位为（-48.53±2.40）mV。

图8 Lyco-NLC粒径分布图Fig.8 Particle size distribution of Lyco-NLC

2.4 稳定性实验结果

表4 稳定性实验结果Table 4 Results of stability experiments

由表4 可知，最优工艺得到的L y c o-N L C 在贮藏30 d后，其包封率为（84.49±0.44）%，粒径为（135.48±7.31）nm，多分散指数及Zeta-电位数据表明，采用乙醇注入-探头式超声法制备的番茄红素纳米结构脂质载体有较好的稳定性。

3 结 论

采用乙醇注入-探头式超声法联合制备Lyco-NLC，通过单因素试验法及星点设计-响应面法优化制备工艺，以包封率及粒径为考察指标，考察各因素及两两交互后对Lyco-NLC的影响，确定Lyco-NLC最佳制备工艺为：水化时间61 min、超声时间10 min、超声功率266.5 W、药脂比为1∶36、固液脂质比例为1∶6，磷酸盐缓冲液pH值为6.8，此条件下得到Lyco-NLC包封率为（90.84±0.41）%，载药量为（2.56±0.01）%，粒径为（126.48±3.87）nm，多分散指数为0.188±0.028，Zeta-电位为（-48.53±2.40）mV，样品状态为粉红色悬浊液。4 ℃条件下贮存30 d后，番茄红素包封率为（84.49±0.44）%，粒径为（135.48±7.31）nm，多分散指数为0.205±0.017，Zeta-电位为（-47.16±2.77）mV，说明此方法制备的Lyco-NLC稳定。

番茄红素具有多种生物学功能，但化学性质不稳定，生物利用率较低[30]，在一定程度上限制其应用，乙醇注入-探头式超声法制备Lyco-NLC过程中无水乙醇为唯一有机溶剂，并且使用量少，无有毒性试剂的引入；星点设计-响应面法优化设计可在中心点处进行多次重现性实验，提高实验的准确性。采用乙醇注入-探头超声法制备的Lyco-NLC包封率和稳定性好，相比于其他传统制备方法，在一定程度上提高Lyco-NLC包封率的同时，减少了有毒有机试剂的引入，可为番茄红素功能食品开发提供一定的参考。