不同提取方法对牡丹籽油品质的影响

彭常梅，方锐琳，赖 敏，邓泽元，刘小如，李 静

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）属毛茛科芍药属植物，是我国传统名花，栽培历史悠久，我国牡丹种植栽培历史已有1 600多年，药用历史2 000余年[1]。许多研究表明牡丹籽油含油量在29%～34%左右，牡丹籽仁经过不同的提取工艺可制成金黄色透明状的牡丹籽油，且不同方法提取的油稳定性不一样，水酶法提取的油在放置了6 个月以后也无明显变化[2]。自2011年3月22日卫生部发布了《关于批准元宝枫巧油和牡丹籽油作为新资源食品的公告》后，牡丹籽油就作为一种新资源的油脂备受相关人士的关注。经研究发现，牡丹籽油中含有亚麻酸、亚油酸、二十二碳六烯酸、丹皮酚、牡丹皂苷、牡丹多糖、岩藻甾醇、角鲨烯等100多种营养生理活性物质，主要功效体现在抗氧化[3]、抗肿瘤、抗菌消炎[4]、降血脂[5]、降血糖[6]、保护肝损伤[7]等方面。毒理学研究表明，牡丹籽油无急性毒性和亚急性毒性，是一种具有较高食用安全性的油[8]。

目前提取牡丹籽油的主要方法有水酶法、微波辅助水酶法、超声波辅助提取法、水代法、有机溶剂浸提法、冷榨法，以及超临界CO2提取法等[9]。牡丹籽油的不同提取方法各有利弊。压榨法得油率较低且需要经热力机械处理，易影响热敏性物质的活性；有机溶剂浸提法存在有机溶剂残留、破坏牡丹籽油生物活性成分、环境污染等安全问题[2]；微波辅助水酶法和水酶法通过机械和/或酶的作用降解植物细胞壁，使油脂释放出[10-11]，具有无毒、无害、可避免产物氧化等优点，是一种提取植物油脂的好方法；水代法制取的油脂品质好，对环境污染少，符合安全、营养、绿色的要求但出油率较低[12]；超临界CO2萃取法中，牡丹籽出油率较高且萃取的时间短，但对设备要求高、成本高，不利于工业化发展[13]。因此，各种提取方法各有所长，其提取率和油脂品质也各不相同。

本研究从提取牡丹籽油的品质出发，探讨了不同方法提取的牡丹籽油的理化指标、货架期、脂溶性伴随物、脂肪酸组成及其挥发性成分，为牡丹籽油提取方法的研究和工业应用提供一定的科学数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牡丹籽、冷榨牡丹籽油（已经过精炼）均购买于山东悦如农业发展有限公司；将牡丹籽人工剥壳后得牡丹籽仁，仁经粉碎（60 目）、烘干（37 ℃，4 h）后使用。

正己烷、石油醚、无水乙醇、氢氧化钾、三氟化硼BF3（溶剂为体积分数14%甲醇）、甲苯（色谱级）、正己烷（色谱级） 西陇科学股份有限公司；β-谷甾醇、角鲨烯、γ-生育酚、植物复合破壁酶、碱性蛋白酶、中温淀粉酶、糖化酶 北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

1100型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、6890N型气相色谱（gas chromatograph，GC）仪、6430型三重串联四极杆质谱联用仪 美国安捷伦公司；G70F20CN3L-C2（S2）微波炉（700 W） 广东格兰仕微博生活电器制造有限公司；DJM胶体磨 上海东华均质机厂；PHS-3C型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；0ZF-6050型真空干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；多功能粉碎机 永康市铂欧五金制品有限公司；Omnion OSI-24油脂氧化稳定性分析仪 北京麦可明科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牡丹籽基本成分的测定

水分质量分数测定参考GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》；粗蛋白质量分数测定参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》；粗脂肪质量分数测定参考GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》；粗多糖质量分数测定采用苯酚-硫酸法[14]；淀粉质量分数测定参考GB 5009.9—2016《食品安全国家标准 食品中淀粉的测定》；灰分质量分数测定参考GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》；粗纤维质量分数测定参考GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中粗纤维的测定》。

1.3.2 牡丹籽油的提取

1.3.2.1 有机溶剂浸提法提取

称取牡丹籽粉300 g与3 000 mL正己烷混合，电动搅拌2 h，4 200 r/min离心10 min，将上清液于37 ℃真空浓缩至干，得到澄清透亮的牡丹籽油。

1.3.2.2 水酶法提取

水酶法提取牡丹籽油参考文献[15]。称取牡丹籽粉100 g，然后以料液比1∶4（m/V）加入蒸馏水。加入3 mL植物复合破壁酶，在45 ℃的水浴摇床上充分酶解2.5 h；接着加2 g/100 g中温淀粉酶，在60 ℃的水浴摇床上充分酶解1.5 h；加入2 g/100 g糖化酶，在60 ℃的水浴摇床上充分酶解1.5 h；最后加入3 g/100 g碱性蛋白酶，在45 ℃的水浴摇床上充分酶解2.5 h。在4 200 r/min离心10 min后吸取上清液，乳液层用冷冻破乳法（乳液于-20 ℃放置18 h，再45 ℃水浴2 h）进行破乳后，将所得油于37 ℃真空浓缩至干，得到澄清透亮的牡丹籽油[15]。

1.3.2.3 微波辅助水酶法提取

称取牡丹籽粉100 g，铺平于培养皿中，微波45 s，其余步骤与1.3.2.2节一致。

1.3.2.4 水代法提油

称取牡丹籽粉100 g，按照料液比1∶6（m/V）加入蒸馏水，过胶体磨2 min，4 200 r/min离心10 min后取上层乳液，将其置于-20 ℃冰箱冷冻18 h后，在45 ℃水浴2 h，4 200 r/min离心10 min，得上清液，即为牡丹籽油。

1.3.3 牡丹籽油理化性质的测定

酸价参考GB 5009.229—2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》测定；过氧化值按GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》的方法测定；碘值按GB/T 5532—2008《动植物油脂 碘值的测定》的方法测定；皂化值按GB/T 5534—2008《动植物油脂 皂化值的测定》的方法测定；货架期用OSI-24型油脂氧化稳定性分析仪测定，即Rancimat法[16]。

1.3.4 牡丹籽油脂溶性伴随物含量的测定

1.3.4.1γ-生育酚含量的测定

γ-生育酚含量的测定参考文献[17]。称取20 mgγ-生育酚标准品于10 mL棕色容量瓶中，正己烷溶解、定容，再稀释成不同质量浓度后过0.22 μm滤膜，用HPLC测定分析得到标准曲线。称取1 g油样于10 mL棕色容量瓶中，正己烷溶解，定容。过0.22 μm滤膜后进行HPLC测定。HPLC测定条件：Hypersil ODS2型色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），紫外检测器，洗脱条件为：体积分数98%甲醇溶液等度洗脱10 min；柱温：室温；流速：0.8 mL/min；进样量：3 μL；检测波长：298 nm[17]。

1.3.4.2 角鲨烯含量的测定

称0.5 g牡丹籽油用5 mL石油醚溶解，过160～200 目硅胶柱，再用一定量石油醚洗柱，收集洗柱后的石油醚。氮气浓缩，加1 mL正己烷振荡混匀，取800 μL过0.45 μm有机滤膜后进行HPLC分析。色谱条件：Hypersil ODS2型色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：V（乙腈）∶V（甲醇）＝6 0∶4 0；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；紫外检测波长：λ＝210 nm[18]。

1.3.4.3β-甾醇含量的测定

称取牡丹籽油1 g，加入5 mL 0.5 mol/L KOH溶液（溶剂为体积分数95%乙醇溶液），皂化30 min，带皂化液冷却至室温后，再加入饱和氯化钠溶液25 mL，移至分液漏斗中用石油醚30 mL提取3 次后，用25 mL蒸馏水多次洗石油醚层至中性。石油醚层用无水硫酸钠脱水后过滤。旋转蒸发干，将残渣用色谱级甲醇定容，漩涡1 min后过0.22 μm滤膜，再进行HPLC测定。色谱条件：Hypersil ODS2型色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：V（甲醇）∶V（超纯水）＝98.5∶1.5；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；紫外检测波长：λ＝210 nm。

1.3.5 牡丹籽油脂肪酸组成的测定

样品甲酯化[19]：称取2 mg油于10 mL的试管中，加入2 mL BF3（体积分数14%甲醇为溶剂），加入1 mL甲苯，氮吹几秒后于90 ℃水浴1 h，冷却至室温后加入3 mL正己烷（色谱级），加入1 mL蒸馏水，密封漩涡1 min，2 000 r/min离心10 min。取上层溶液过无水Na2SO4柱后氮吹至干，加入1.0 mL正己烷，过0.45 μm的滤膜。

G C 条件： C P - S i l 8 8 熔融石英毛细管柱（100 m×0.25 mm，0.2 μm）；进样口温度为250 ℃，压力为24.52 psi，总流速为29.4 mL/min，恒压不分流进样模式，进样量为1 μL；载气为氢气（99.99%），柱压为24.52 psi。色谱柱升温程序：起始温度45 ℃，保持4 min；以 13 ℃/min的速率升至175 ℃并保持27 min；再以4 ℃/min升温至215 ℃并保持35 min，总共持续时间86 min。火焰离子化检测器：250 ℃，以氢气和空气为燃气，流速分别为30 mL/min和300 mL/min；助燃气为氮气（99.99%），流速30 mL/min。

1.3.6 牡丹籽油挥发性成分的测定

样品预处理：称取5 g牡丹籽油于20 mL的顶空品中，密封。在磁力加热搅拌器中于80 ℃下平衡30 min后用DVB/CAR/PDMS型萃取头萃取60 min，待测。

GC条件：HP-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），程序升温条件为40 ℃保持5 min，以4 ℃/min升高到180 ℃，以10 ℃/min升高至220 ℃后保持5 min。进样口的温度250 ℃，柱前压力7.62 psi，氦气流速1.0 mL/min，分流比5∶1，溶剂延迟时间1 min。质谱（mass spectrometry，MS）条件：采用电子轰击离子源，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量70 eV，发射电流34.6 μA，倍增器电压1 206 V，辅助加热器温度280 ℃，质量范围30～500 amu[20]。

1.4 数据处理与分析

所有实验每组样品每个指标独立测定3 次，数值以平均值±标准偏差表示。用SPSS 17.0软件单因素方差分析中的Duncan’s检验数据进行差异性显著分析，P＜0.05表示差异显著。采用Excel 2010软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法对牡丹籽油理化性质的影响

经测定，牡丹籽主要成分为粗脂肪和粗蛋白。其中粗脂肪和粗脂肪质量分数分别达到31.04%、17.89%，其他成分质量分数分别为：淀粉10.36%、粗多糖8.69%、粗纤维7.21%、水分6.5%、灰分2.7%。不同提取方法对牡丹籽油理化性质的影响见表1。不同方法提取的牡丹籽油的碘值差异不大，而酸价、过氧化值、皂化值、货架期存在显著差异。冷榨法提取的油酸价（0.769 mg/g）比其他4 种方法提取得到的低，这可能是因为市售的油经过脱酸处理。水酶法提取的油过氧化值（0.007 g/100 g）最低，几乎测不出来，与彭媛媛等[15]研究的结果一致。牡丹籽油酸价、过氧化值、皂化值最低的提取方法均是水酶法，但与水代法提取油的这些指标无显著差异，说明酶不会影响油的品质指标，这与Soto等[21]的研究结果相似。因此，基于牡丹籽有物理特性，发现水酶法提取的牡丹籽有具有较低的酸价和过氧化值。

表1 不同方法提取的牡丹籽油理化性质对比Table 1 Comparison of physicochemical properties of peony seed oils prepared by different methods

2.2 不同提取方法对牡丹籽油中脂溶性伴随物含量的影响

表2 不同方法提取的牡丹籽油中主要脂溶性伴随物含量的对比Table 2 Comparison of fat-soluble concomitant contents in peony seed oils prepared by different methods

从表2可知，5 种不同方法得到的牡丹籽油的γ-生育酚、角鲨烯、β-谷甾醇含量有明显的差异。5 种提取方法得到的脂溶性伴随物含量由高到低的顺序为：水酶法＞水代法＞微波辅助水酶法＞有机溶剂法＞冷榨法。葛杭丽等[22]比较了不同方法提取茶油的脂溶性伴随物，也发现水酶法、水代法和微波辅助水酶法提取的茶油的脂溶性伴随物含量显著高于溶剂法和冷榨法。这是由于水酶法提取过程中利用纤维素酶对牡丹籽进行破壁处理，期间牡丹籽中大量的抗氧化物质得以溶出，而且酶解能够降低角鲨烯与种子中多糖、蛋白质和果酸的作用程度，促进角鲨烯释放到油中[23]，提高油脂的抗氧化性。此外，微波辅助水酶法提取的牡丹籽油中脂溶性伴随物含量均比水酶法低，说明微波会对牡丹籽中抗氧化物质造成损失。因此，水酶法提取的牡丹籽油中脂溶性伴随物含量最高，抗氧化性最强。

2.3 不同提取方法对牡丹籽油货架期的影响

由图1可知，不同的加工方式对牡丹籽油货架期影响很大。货架期是衡量油脂抗氧化能力强弱的一个指标，水酶法提取的牡丹籽油货架期（4.67 h）最长，极显著长于其他4 种方法（P＜0.01）。这可能是由于水酶法提取的牡丹籽油中脂溶性伴随物如γ-生育酚、角鲨烯、β-谷甾醇的含量均高于其他4 种方法，这些脂溶性伴随物均具有抗氧化能力，可延长货架期。此外，有机溶剂法提取的牡丹籽油货架期（3.68 h）也极显著长于微波辅助水酶法、水代法和冷榨法，这表明牡丹籽油的抗氧化能力不仅仅与脂溶性伴随物质含量密切相关，还可能与其含有的一些酚类物质相关。

图1 不同方法提取的牡丹籽油的货架期对比Fig.1 Comparison of shelf lives of peony seed oils prepared by different methods

2.4 不同提取方法对牡丹籽油脂肪酸组成的影响

表3 不同方法提取的牡丹籽油中脂肪酸组成的对比Table 3 Comparison of fatty acid compositions in peony seed oils prepared by different methods

由表3 可知，水酶法、水代法、微波辅助水酶法、有机溶剂浸提法、冷榨法得到的牡丹籽油脂肪酸主要是油酸（9c18:1，22.59%～24.84%）、亚油酸（9c12c18:2n-6，24.88%～27.07%）和α-亚麻酸（18:3n-3，35.66%～37.68%），亚油酸与α-亚麻酸的相对含量之比为1∶1.34～1∶1.48。牡丹籽油UFA含量高，其必需脂肪酸（α-亚麻酸）含量与亚麻籽油的接近，是食用油和营养供应的最佳来源[24]。5 种方法提取的牡丹籽油脂肪酸组成有差异，冷榨法提取的牡丹籽油中UFA相对含量显著低于其他4 种（P＜0.05），白章振等[25]也发现冷压榨提取的牡丹籽油比水酶法的UFA相对含量低。此外，水酶法提取的牡丹籽油中反式脂肪酸相对含量显著低于其他4 种方法（P＜0.05），而反式脂肪酸对人体有较多负面影响。从脂肪酸角度来看，不同提取方法提取的牡丹籽油脂肪酸组分相似，但是水酶法提取的牡丹籽油反式脂肪酸相对含量最低，因此水酶法提取的牡丹籽油更安全、健康。

2.5 不同提取方法对牡丹籽油中挥发性成分的影响

陈鸿平等[26]研究了不同炮制程度的白术挥发物成分，结果表明随着焙炒程度的加深，挥发油含量随炮制火候变化呈4 个阶段梯度下降，白术挥发性成分在组成和含量上均有显著变化。邓龙等[20]用顶空固相微萃取（head space-solid phase microextraction，HS-SPME）技术结合GC-MS-电子鼻嗅闻仪联用测定了8 种不同加工方式（不同品牌）橄榄油中的挥发性成分，发现橄榄油的风味贡献物质以醛类、酯类和醇类为主，且挥发性成分有明显的差异。陈燕銮等[27]探讨了3 种不同方法提取的北细辛挥发油成分，发现水蒸气蒸馏法和超临界CO2萃取法提取北细辛的挥发油有36 种成分，其中相同的成分有16 种，但各成分含量不相同。综上所述，不同加工方式对植物油的挥发性组分有显著影响。因此，本实验利用GC-MS对牡丹籽油挥发性成分进行分析，以期获得牡丹籽油的特征风味物质，以及不同加工方式对牡丹籽油挥发性组分的影响。

表4 不同提取方法对牡丹籽油挥发性成分的影响Table 4 Effects of different extraction methods on volatile components of peony seed oil

续表4

续表4

由表4、5可知，牡丹籽油中共鉴定出106 种挥发性物质，其中烃类（烷烃18 种，烯烃15 种）、醇类（18 种）、酸类（13 种）、酯类（14 种）、醛类（19 种）、酮类（5 种）和其他类（4 种）。5 种方法提取的牡丹籽油共有的挥发性成分有醛类（α-甲基肉桂醛、己醛等）、酯类（棕榈酸乙酯）以及烃类（十二甲基环六硅氧烷、十八甲基环九硅氧烷、八甲基环四硅氧烷等）。

表5 不同方法提取的牡丹籽油挥发性成分的种类Table 5 Number of volatile components in peony seed oils prepared by different methods

不同加工方式提取的牡丹籽油挥发性组分不同。冷榨法：烃类主要是甲硼烷（4.75%）、十六甲基七硅氧烷（9.93%）和1-甲氧基-1-丙烯（10.41%），醛类主要是正己醛（4.45%）、(E,E)-2,4-庚二烯醛（8.89%）和(E,E)-2,4-癸烯醛（3.95%），酸类主要是顺十八碳烯酸（5.4%）和n-棕榈酸（3.39%）；水酶法：烃类主要是2,4-二甲基己烷（1.08%）和2-甲基-6-亚甲基-2-辛烯（1.15%），醛类主要是(E)-2-己烯醛（2.48%）和α-甲基肉桂醛（38.01%），醇类主要是(Z)-2-戊烯-1-醇（4.64%），酯类主要是苯甲酸甲酯（6.12%）和苯甲酸乙酯（8.12%）；水代法：烃类主要是2-乙基氧杂环丁烷（13.95%）和十八甲基环九硅氧烷（39.70%），酸类主要是苯甲酸（11.37%）和油酸（13.06%），醛类主要是己醛（3.87%）；微波辅助水酶法：烃类主要是2-乙基氧杂环丁烷（31.67%）和十八甲基环九硅氧烷（41.05%），酸类主要是油酸（5.59%）和n-棕榈酸（2.35%），醛类主要是己醛（2.01%）和α-甲基肉桂醛（2.29%）；溶剂法：烃类主要是庚烷（9.9%）和十八甲基环九硅氧烷（20.56%），醛类主要是(E,E)-2,4-癸二烯醛（2.69%），酸类主要是亚油酸（55.51%）。

醛类物质主要由不饱和脂肪酸氧化分解而来[28]，且气味阈值较低，而冷榨和精炼过程物质之间转变较多且容易导致脂肪酸的氧化，故冷榨法检测出比其他4 种方法更多种类的醛类物质（表4、5）。壬醛、(E)-2-癸烯醛、正己醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-己烯醛、(E)-2-辛烯醛、戊醛和2-戊基呋喃这些油酸和亚麻酸的氢过氧化物产物在冷榨法或水代法或微波辅助水酶法提取的油中相对含量大于其他两种，说明这3 种油氧化程度更大，这与前文水酶法和有机溶剂浸提的油抗氧化能力更强相呼应。Zhang Kun等[29]通过GC-MS分析了美国甜橙油和巴西柑桔油橘精油成分，结果发现与其他提取方法相比，用酶法提取的精油中酯类（主要是乙基酯）相对含量增加的范围为10%～1 170%，而本研究中也发现用水酶法提的牡丹籽油酯类相对含量（18.91%）比其他4 种方法高很多，说明酶可能催化产生更多的酯类物质。从表5可知，与其他4 种方法相比，采用有机溶剂萃取的牡丹籽油挥发性成分种类最少，主要是酸类（55.51%）和环氧烷烃（28.33%）两大类物质，有可能是因为有机溶剂萃取对牡丹籽油组分破坏大[30]。同时，发现冷榨法提取的牡丹籽油挥发性成分的种类是最多。Steenson等[31]利用SPME-GC-MS技术对大豆油和玉米油中的挥发性成分进行了分析鉴定，发现大豆油在过氧化值为5 时的挥发性成分种类多于过氧化值为1时，这与冷榨法提取的油过氧化值显著大于其他4 种方法的结果相一致。

食品风味作为食品重要的品质指标之一，对食品的口感、滋味及气味等方面都起着重要的作用，而植物油挥发性风味成分主要是由脂肪氧化和脂溶性化合物挥发形成[32]。由表4可知，5 种方法获得的牡丹籽油的挥发性成分中烃类和酸类的占比相对较高，具体如下：水代法（烃类：60.72%，酸类：27.48%）；微波辅助水酶法（烃类：79.36%，酸类：8.31%）；溶剂法（烃类：38.57%，酸类：55.67%）；冷榨法（烃类：45.06%，酸类：9.77%）；水酶法（烃类：11.62%，酸类：1.60%）。烃类物质即碳氢类物质，有一部分是植物油脂肪酸氧化降解产生的烷烃类物质；酸类物质是植物油中游离脂肪酸断裂产物。但是烃类物质和酸类物质阈值比较高，对于植物油的气味贡献度不大[34]，故实验得到的不同气味的油的香气主要由其他几种挥发性成分提供。冷榨法的醛类和酮类物质相对含量较高，而醛类有青草、脂肪等风味；酮类一般具有果香和药香；水酶法的醛类（42.99%）、酯类（18.91%）和醇类（9.21%）物质相对含量最高，而酯类有水果酒香气；醇类有芳香、植物香、酸败和土气等风味。不同提取方式得到的油挥发性成分差异很大，使得油的气味不同，可通过挥发性组分的分析鉴别提取方式，为牡丹籽油的标准的完善提供科学依据。

3 结 论

本实验对冷榨法、溶剂浸出法和微波辅助水酶法、水代法、水酶法对牡丹籽油脂理化指标、主要脂肪酸组成及含量、脂溶性伴随物的含量影响进行了研究。结果发现，牡丹籽油主要脂肪酸有是油酸（22.59%～24.84%）、亚油酸（24.88%～27.07%）和α-亚麻酸（35.66%～37.68%），亚油酸与α-亚麻酸的相对含量之比为1∶1.34～1∶1.48。水酶法提取的牡丹籽油酸价、过氧化值、碘值较低，脂溶性伴随物（γ-生育酚、角鲨烯、β-谷甾醇）含量高于其他4 种提取方式，货架期最长。因此，水酶法提取的牡丹籽油品质最佳。

此外，本项目通过GC-MS分析牡丹籽油挥发性组分发现，5 种不同提取方法得到的牡丹籽油共有的挥发性成分有醛类（α-甲基肉桂醛和己醛等）、酯类（棕榈酸乙酯）以及烃类（十二甲基环六硅氧烷、十八甲基环九硅氧烷、八甲基环四硅氧烷）。不同加工方式对牡丹籽油挥发性组分影响显著。该结果为牡丹籽油挥发性组分提供了详细的科学数据，并为牡丹籽油标准的完善提供了依据。