产蛋白酶菌株的筛选及以菜籽粕为氮源的产酶条件优化

陈 茏，杨 俊，马毛毛，吴莎莎，余 平,3，曾哲灵,3,*

（1.南昌大学食品学院，江西 南昌 330031；2.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；3.南昌大学资源环境与化工学院，江西 南昌 330031）

蛋白酶是水解蛋白质氨基酸基团之间的肽键的酶，是构成重要的工业酶类之一。目前，工业酶的全球销售额估计为42亿 美元[1-2]，而蛋白水解酶约占60%。蛋白酶常用于洗涤剂、食品蛋白质、酿造、肉类、皮革和乳制品行业[3-6]，为提高营养价值、消化率、适口性、风味和减少变应原性化合物，处理生活垃圾和工业废物，以及参与蛋白质的合成和结构解析作出了重要贡献[7]。蛋白酶广泛存在于各种微生物、动物和植物中[8]，由于微生物具有快速生长、生长所需的空间小以及易于遗传操作等经济和技术优势，是目前工业蛋白酶的主要来源。一些产蛋白酶的微生物陆续被发现，如真菌类中的霉菌及酵母菌[9-11]等，细菌中的枯草芽孢杆菌属（Bacillus subtilis）[12]，盐单胞菌属（Halomonas）[13]等。近年来，世界各地对蛋白酶的需求呈现上升的趋势，人们愈发关注高产蛋白酶菌株的研究[14]。邓维琴等[15]从豆瓣酱中筛选出17 株高产蛋白酶菌株。王庆龄[16]从南极磷虾中筛选出低温下高产蛋白酶菌株。如何获得新的高产蛋白酶菌株，越来越成为当前研究的热点。

蛋白酶生产原料成本约占总成本的40%。传统方法一般以豆粕作为发酵原料以生产蛋白酶，但是随着养殖业的快速发展，大量豆粕被用作饲料，无法满足酶工业需求，因此，寻找价格低廉、营养价值高的蛋白酶原料迫在眉睫[17]。我国油菜籽产量居世界首位，占全球油菜籽产量的21.14%[18-19]，菜籽粕作为这种油料作物的低廉废料，其蛋白质含量较高，为干物质的33.9%～36%，因此，具有作为发酵原料产蛋白酶的潜力。此外，蛋白酶的微生物合成受到多种因素的影响，例如温度、pH值、碳源、氮源、发酵时间和发酵类型[20]，其中碳源和氮源的类型及其浓度的合理使用对酶生产成本的降低起到至关重要的作用。因此，优化工艺条件是酶生产过程中非常必要的一步。

本实验从食堂污水中筛选出1 株高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌CL-10，将其作为出发菌，以菜籽粕作为发酵的氮源，以单因素试验和响应面法优化培养基组成，以期为蛋白酶生产成本的降低和菜籽粕的资源化利用提供理论和方法指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品与试剂

样品来源：南昌大学食堂污水。

酪氨酸标准样品、福林-酚、脱脂奶粉 北京索莱宝生物科技有限公司；DNA提取试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；干酪素 天津市大茂化学试剂厂；蛋白胨、牛肉膏 北京奥博星生物技术有限责任公司；菜籽粕、花生粕、豆粕、芝麻粕 南昌市农贸市场；MgSO4、CaCl2、NaCl2、葡萄糖、硫酸铵、表面活性剂、无水碳酸钠等无机盐离子 西陇科学股份有限公司。所有试剂均为国产分析纯。

1.1.2 培养基

初筛培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，脱脂牛奶1.5%，脱脂牛奶单独灭菌在110 ℃灭菌15 min；LB培养基（种子培养基）：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，氯化钠1%；基础发酵培养基：豆粕4%，玉米粉3%，麸皮3%，KH2PO40.03%，Na2HPO4g 12H2O 0.4%，pH值为自然。以上培养基在121 ℃灭菌锅灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

UZWY-2102C恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；TU-1950紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；ST 16R低温高速离心机 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；YXQ-LS立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；XSZ-4G型中级生物显微镜 重庆光电仪器有限公司；JSM 6701F型场发射扫描电镜带能谱仪 日本电子株式会社。

1.3 方法

1.3.1 发酵培养

参考肖彦骏等[21]关于培养解淀粉芽孢杆菌培养的方法并适当修改。用接种环取斜面保存的菌株2 环，接入装有25 mL LB培养基的锥形瓶中，200 r/min、37 ℃培养12 h进行活化作为种子液。将活化好的菌液按4%的接种量接入装有50 mL发酵培养基的锥形瓶中，200 r/min、37 ℃培养48 h，10 000 r/min离心取上清发酵液，测定蛋白酶活力。

1.3.2 菌种筛选

初筛：取食堂污水样品用梯度稀释法稀释适当倍数，将稀释的样品涂布于初筛培养基平板上，平板在37 ℃培养24 h。用接种环挑取有明显水解圈的菌株划线挑取单菌落，用游标卡尺测量水解圈和菌落直径，选取水解圈直径与菌落直径比值较大的菌株作为初筛的产蛋白酶菌株。

复筛：将初筛筛选的比值较大的菌株接种于基础发酵培养基中，37 ℃发酵48 h后离心取上清液，测定发酵液中蛋白酶活力，选取酶活力最高的菌株命名为CL-10。

1.3.3 菌株的鉴定

参照文献[22]通过菌株形态观察、扫描电镜、各种生理生化实验和16S rRNA测序鉴定产生蛋白酶的菌株。使用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，参照权淑静等[23]的方法扩增菌株16S rDNA，将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送上海美吉生物测序。通过GenBank数据做相似性分析，使用MEGA7.0软件构建系统发育树。

1.3.4 蛋白酶活力测定和平均氮源成本

按照GB/T 23527ü 2009《蛋白酶制剂》[24]，采用福林-酚法测定中性蛋白酶活力。酶活力单位定义：1 mL液体酶在40 ℃、pH 7.5条件下，1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸，即为一个酶活力单位，以U/mL表示。

平均氮源成本=氮源消耗质量×氮源单价/单位酶活力×发酵总体积；菜籽粕单价=0.66豆粕单价=0.49花生粕单价=0.58芝麻粕单价。

1.3.5 单因素试验确定发酵培养基成分

1.3.5.1 氮源种类和含量对解淀粉芽孢杆菌产蛋白酶的影响

将基础发酵培养基中的豆粕分别用4%的菜籽粕、花生粕、芝麻粕、牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵替换，进行发酵培养，以发酵上清液中蛋白酶活力为指标，确定最佳氮源种类。将选择出的氮源质量分数分别设为3%、4%、5%、6%、7%、8%，以发酵上清液中蛋白酶活力为指标，确定最佳氮源含量。

1.3.5.2 碳源种类和含量对解淀粉芽孢杆菌产蛋白酶的影响

在上述优化的基础上，将基础发酵培养基中的葡萄糖分别用3%麦芽糖、甘油、淀粉、葡萄糖、乳糖、糊精、玉米粉替换，进行发酵培养，以发酵上清液中蛋白酶活力为指标，确定最佳碳源种类。将选择出的碳源质量分数分别设为1%、2%、3%、4%、5%、6%，以发酵液上清中蛋白酶活力为指标，确定最佳碳源含量。

1.3.5.3 麸皮质量分数对解淀粉芽孢杆菌产蛋白酶的影响

在上述优化的基础上，将基础发酵培养基中的麸皮质量分数设为1%、2%、3%、4%、5%、6%，进行发酵培养，以发酵上清液中蛋白酶活力为指标，确定最佳麸皮质量分数。

1.3.5.4 表面活性剂种类和体积分数对解淀粉芽孢杆菌产蛋白酶的影响

在上述优化的基础上添加表面活性剂进行发酵培养，表面活性剂分别为体积分数0.4%的吐温20、吐温60、吐温80、曲拉通X-100，以发酵上清液中蛋白酶活力为指标，确定最佳表面活性剂种类。将选择出的表面活性剂体积分数分别设为0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%，以发酵上清液中蛋白酶活力为指标，确定最佳表面活性剂浓度。

1.3.5.5 金属离子种类和质量分数对解淀粉芽孢杆菌产蛋白酶的影响

在上述优化的基础上添加金属离子进行发酵培养，金属离子分别为质量分数0.1%的Fe2(SO4)3、MgSO4、ZnSO4g 7H2O、CaCl2、CuSO4、MnCl2g 4H2O、Al(NO3)3g 9H2O，以发酵液上清中蛋白酶活力为指标，确定最佳金属离子种类。将选择出的金属离子盐质量分数分别设为0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%，以发酵上清液中蛋白酶活力为指标，确定最佳金属离子质量分数。

1.3.6 发酵培养基响应面试验优化

以单因素试验结果为基础，确定对发酵产蛋白酶最具影响的3 个因素菜籽粕质量分数（A）、玉米粉质量分数（B）、麸皮质量分数（C），以蛋白酶活力（Y）作为响应值，采用Design-Expert 10.0.1软件，应用Box-Behnken方法设计试验组合，优化和验证产酶最佳发酵条件，因素与水平见表1。

表1 响应面试验设计因素与水平Table 1 Code and level of independent variables used for Box-Behnken design

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

经过初筛和复筛，筛选出1 株基础产蛋白酶活力为2 715 U/mL的菌株，并命名为CL-10，参照文献[22]，对菌株CL-10进行生理生化鉴定实验。如图1所示，该菌株水解圈与菌落直径比较大，菌体呈短杆状。由表2可知，菌株CL-10为芽孢杆菌属。由图2可知，菌株CL-10与解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）MPA1034在同一分支，序列相似性为100%。综合菌株的形态特征、生理生化特性、16S rDNA序列以及系统进化树的结果，可以将分离菌株CL-10鉴定为解淀粉芽孢杆菌。

图1 菌株CL-10蛋白酶水解圈形态（A）和扫描电镜形态（B）Fig.1 Proteolytic circles (A) formed by strain CL-10 and scanning electron microscope morphology (B)

表2 菌株生理生化鉴定结果Table 2 Physiological and biochemical identification of the strain

图2 菌株CL-10 16S rDNA序列系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain CL-10 based on 16S rDNA sequence

2.2 发酵培养基成分的确定

2.2.1 氮源对解淀粉芽孢杆菌产蛋白酶的影响

从图3a可知，不同氮源对产酶影响有较大差异，有机氮源比无机氮源更有利于发酵产酶。其中，以成本最低的菜籽粕作为氮源时，酶活力最大，达到3 891.5 U/mL，与以豆粕作为氮源的基础发酵培养基相比，酶活力提高了43.3%，平均氮源成本低。菜籽粕中蛋氨酸和赖氨酸等氨基酸成分的含量较高[25]，钙、磷、硒、锰矿物质含量高，这些氨基酸和矿物质对解淀粉芽孢杆菌的生长和产酶有明显的促进作用，这可能是菜籽粕作为氮源大大促进解淀粉芽孢杆菌产蛋白酶的原因。进一步优化得菜籽粕质量分数为6%时（图3b），蛋白酶活力最高为4 339.7 U/mL，因此选择6%的菜籽粕作为优化发酵培养基氮源。

图3 氮源种类（a）和菜籽粕质量分数（b）对解淀粉芽孢杆菌产蛋白酶的影响Fig.3 Effects of nitrogen source (a) and rapeseed meal (b) on protease production by B.amyloliquefaciens

2.2.2 碳源对解淀粉芽孢杆菌产蛋白酶的影响

图4 碳源种类（a）和玉米粉质量分数（b）对解淀粉芽孢杆菌产蛋白酶的影响Fig.4 Effects of carbon source (a) and corn flour (b) on protease production by B.amyloliquefaciens

从图4a可以看出，当玉米粉作为碳源时蛋白酶活力最高，其余依次为葡萄糖、糊精、淀粉、甘油、乳糖、麦芽糖，这可能是因为玉米粉中含有多种微生物需要的营养成分，能促进蛋白酶的生成。当玉米粉质量分数为4%时有最高酶活力4 409 U/mL（图4b）。解淀粉芽孢杆菌产酶需要足够的碳源，浓度较低导致微生物营养不充分，影响生长代谢，进而影响产酶，但玉米粉浓度过高培养基较黏稠，不利于代谢进而抑制产酶。因此选择4%的玉米粉粕作为优化发酵培养基碳源。

2.2.3 麸皮质量分数对解淀粉芽孢杆菌产蛋白酶的影响

图5 麸皮质量分数对解淀粉芽孢杆菌产蛋白酶的影响Fig.5 Effect of wheat bran on protease production by B.amyloliquefaciens

麸皮中含有较多的维生素及微量元素，在微生物发酵过程中常被用作生长因子添加到发酵培养基中。由图5可知，在1%～3%之间，随着麸皮质量分数的增加，酶活力逐渐增加，在3%达到产酶最大值4 422.4 U/mL，大于3%酶活力逐渐减少。因此选择优化发酵培养基的麸皮质量分数为3%。

2.2.4 表面活性剂对解淀粉芽孢杆菌产蛋白酶的影响

图6 表面活性剂（a）和吐温20体积分数（b）对解淀粉芽孢杆菌产蛋白酶的影响Fig.6 Effects of surfactant type (a) and Tween 20 (b) on protease production by B.amyloliquefaciens

由图6a可知，表面活性剂吐温80、吐温60对解淀粉芽孢杆菌产蛋白酶有轻微的抑制效果，曲拉通的抑制效果最明显，相反，表面活性剂吐温20对发酵产蛋白酶有促进效果。相对于对照组，添加吐温20酶活力提高了6.8%，是因为吐温20作为一种非离子型表面活性剂，可以增大细胞膜的渗透性，减少酶在细胞膜上的吸附量，细胞内的酶更容易透过细胞膜而分泌出来[26-27]。在吐温20体积分数为0.7%时达到最大值5 156.7 U/mL（图6b），因此选择优化发酵培养基中表面活性剂为吐温20且体积分数为0.7%。

2.2.5 金属离子对解淀粉芽孢杆菌产蛋白酶的影响

图7 金属离子种类（a）和ZnSO4g 7H2O质量分数（b）对解淀粉芽孢杆菌产蛋白酶的影响Fig.7 Effects of metal ions (a) and ZnSO4·7H2O concentration (b) on protease production by B.amyloliquefaciens

研究发现，添加少量的金属离子对蛋白酶活性有显著提高[28]。由图7a可知，对酶活力影响最大的是ZnSO4g 7H2O，提高了10.2%，这是因为部分中性蛋白酶活性部位不含Zn2+，额外加入的Zn2+能通过疏水键结合、金属结合和离子相互作用等方式提高中性蛋白酶的热稳定性[29]。因此，出于发酵培养基简单原则，选择添加ZnSO4g 7H2O。ZnSO4g 7H2O质量分数在0.2%达到最大值5 841.3 U/mL（图7b），随着ZnSO4g 7H2O质量分数增加，酶活力逐渐降低，这是因为离子浓度过高对微生物产酶产生抑制作用。因此选择添加ZnSO4g 7H2O且质量分数为0.2%。

2.3 响应面设计结果与分析

2.3.1 模型建立与显著性检验

以菜籽粕质量分数（A）、玉米粉质量分数（B）、麸皮质量分数（C）为响应面试验的3 个因素，以蛋白酶活力（Y）为响应值，通过3因素3水平的Box-Behnken试验设计和响应面分析方法，确定解淀粉芽孢杆菌发酵菜籽粕产蛋白酶最佳工艺条件，结果见表3。应用Design-Expert 10.0.1软件进行多元回归拟合分析，各试验因素对响应值的综合影响可用如下多元二次回归方程表示：Y=6 409.58+88.18A+140.90B+237.33C-37.85AB-2.50AC-252.20BC-290.82A2-113.87B2-354.31C2。

表3 响应面试验设计方案及结果Table 3 Box-Behnken design and experimental results for response surface analysis

表4 响应面分析试验方差分析结果Table 4 Analysis of variance for the developed regression model

如表4所示，整体模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.106 7），说明该回归方程可真实反映自变量和因变量的关系，模型中的R2为97.8%，调整后为95%，说明95%的响应值变化可以通过模型进行解释，因此可以用此模型进行分析和预测。

2.3.2 各因素交互作用分析

图8 各因素交互作用对解淀粉芽孢杆菌产蛋白酶的影响Fig.8 Response surface plots showing the interactive effects of rapeseed meal, corn flour and wheat bran levels on protease production by B.amyloliquefaciens

由图8可以看出，蛋白酶活力随着菜籽粕质量分数、玉米粉质量分数、麸皮质量分数的变化出现先升高后降低的趋势，其中BC交互作用为极显著，AB和AC为不显著。通过优化得到解淀粉芽孢杆菌发酵产蛋白酶的最佳工艺参数为菜籽粕质量分数6.125%、玉米粉质量分数4.375%、麸皮质量分数3.199%，该条件下的蛋白酶活力预测值为6 465.4 U/mL。根据实际称量的方便将工艺参数调整菜籽粕质量分数6.1%、玉米粉质量分数4.4%、麸皮质量分数3.2%，在此条件下进行3 组平行验证实验，得到蛋白酶活力平均值为6 385.1 U/mL，平均氮源成本降低了54.6%。实际值与预测值有很好的拟合性，进而验证了模型的有效性。相比较于耿芳等[30]从土壤中筛选的产蛋白酶活力1 932.3 U/mL的黏质沙雷氏菌，Zeng Cheng等[31]筛选的产酶为4 536.5 U/mL的解淀粉芽孢杆菌，游玟娟等[32]筛选的产酶2 665.2 U/mL的枯草芽孢杆菌，本实验筛选的菌株优势明显。此外，温拥军等[33]和于新颖[34]同样通过发酵菜籽粕产蛋白酶，结果分别为2 602.7 U/mL和1 959.82 U/mL，亦低于本研究的结果。因此，本研究筛选的菌株和发酵条件，可高效生产蛋白酶。

3 结 论

本研究筛选出1 株高产蛋白酶的菌株，通过形态学观察，生理生化实验和16S rDNA测序鉴定为解淀粉芽孢杆菌CL-10。以此为出发菌，通过单因素试验和响应面优化培养基成分，探究出最佳发酵培养基条件为：菜籽粕质量分数6.1%、玉米粉质量分数4.4%、麸皮质量分数3.2%、ZnSO4g 7H2O质量分数0.2%、吐温20体积分数0.7%。相较于基础培养基，在最优条件下，酶活力从2 715 U/mL提高到6 385.1 U/mL，平均氮源成本降低了54.6%。本实验用解淀粉芽孢杆菌发酵菜籽粕产蛋白酶，具有酶活力高、成本低、工艺简单的特点，可以作为蛋白酶工艺优化和菜籽粕的资源化利用的方法。但是现阶段该菌的酶活相对于工业化生产的菌株还有距离，期待后期通过进一步优化及诱变得到可以进行工业化生产的菌株。