痰诱导涂片COPD 分型与急性加重期患者肺功能及炎症因子的关系

蔡晓盛 陈芒芒 龚昌要 池琼 潘景业

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）病程长，病情复杂，且易反复发作。据WHO 估计，全世界约有3.28 亿COPD 患者，到2030年COPD 将成为全球第三大死亡原因[1]。炎症细胞在肺部聚集并被激活被认为是导致COPD 慢性炎症反应的中心环节[2-3]。近年来有学者将痰诱导涂片技术用于评估COPD 急性加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD）的疾病严重程度，并逐渐发现其在评估气道炎症细胞及炎症因子中的重要性，为COPD 的诊断及治疗提供了重要的参考价值[3-7]。基于诱导痰中炎症细胞的种类及数量不同，可将AECOPD 患者分为嗜酸性粒细胞型（EOS型）、中性粒细胞型（NE 型）、粒细胞缺乏型（AGR 型）、混合粒细胞型（MIX 型）。本研究对基于痰诱导涂片的COPD 分型与AECOPD 患者肺功能指标及炎症因子的相关性进行分析，评估不同分型患者对治疗的反应性，为AECOPD 患者尽早开展个性化临床治疗及对预后评估提供参考依据。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2016 年6 月至2017 年1 月温州市中心医院呼吸内科收治的AECOPD 患者122 例作为研究对象，其中男65 例，女57 例；身高（159.8±6.1）cm；体重（67.3±9.4）kg；年龄44～79（62.7±5.2）岁；病程5～13（8.41±1.24）年。AECOPD 诊断标准：所有患者均符合中华医学会呼吸病学分会制定的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2013 年修订版）》的诊断标准[8]：患者均已确诊为COPD，短期内出现急性加重，咳嗽、咳痰增多或痰液呈脓性、呼吸困难，超出日常的变异，排除心力衰竭等其他可能病因，并需要改变药物治疗。排除标准：（1）合并严重肝肾功能不全、内分泌系统、血液系统、风湿免疫系统疾病等患者；（2）肺癌、活动性肺结核及肺炎、严重支气管扩张、支气管哮喘患者；（3）近期严重外伤、手术患者；（4）无法进行痰诱导、肺功能检测的患者及不愿参与研究的患者。本研究经医院医学伦理委员会审批通过，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 痰诱导及涂片染色 所有患者入院后48 h 内进行痰诱导及肺功能检测。操作方法：（1）向患者讲解痰诱导产生的不适以及痰诱导后会产生过量的黏液，诱导前将患者的基本资料（包括身高、体重）输入电脑中，然后按照美国胸科协会指南检测患者的肺功能指标[包括第一秒用力呼气容积（forced expiratory volume in one second，FEV1）、用力肺活量（forced vital capacity，FVC）]并记录。（2）通过储雾罐装置吸入沙丁胺醇2喷[规格：100 μg/支，批号：16110012/B，葛兰素史克制药（苏州）有限公司]，10 min 后第2 次测量患者的肺功能指标并记录。（3）嘱患者平静呼吸时吸入超声雾化后的3%氯化钠溶液7 ml，每次吸入后鼓励患者积极咳嗽，清理鼻咽腔后收集痰液。（4）再测FEV1，若FEV1下降不超过10%则继续操作；若FEV1下降10%～20%，则再次吸入沙丁胺醇2 喷；如果再次吸入沙丁胺醇后没有改善则应终止试验，如果有改善则可继续痰诱导。（5）必要时重复以上步骤，结束诱导条件为诱导所得的标本已足够实验需要。（6）在30 min 内结束诱导过程，结束后复测FEV1。（7）在诱导过程中患者出现胸闷、咳嗽等不适症状应立即停止诱导。（8）测量痰液重量后，加入4 倍痰液重量的0.1%二硫苏糖醇（批号：3577B051，卡迈舒上海生物科技有限公司），反复吹打，震荡5 min 后，在37 ℃水浴15 min，经无菌纱布过滤后，1 000 r/min 离心5 min，取离心沉淀物进行细胞涂片染色。

1.2.2 AECOPD 分型标准[5]痰涂片染色后进行细胞计数、分类，共计数400 个炎症细胞，包括中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及巨噬细胞；同时记录鳞状上皮细胞，鳞状上皮细胞比例＞80%被认为痰标本污染。标本评价：标本评分＞18 分为良好，8 分≤标本评分≤18 分为中等，标本评分＜8 分为差。痰涂片评分＞18 分可进行细胞计数分型。痰涂片评分标准见表1。依据痰样本中嗜酸性粒细胞百分比是否＞2.5%以及中性粒细胞百分比是否＞61%，将AECOPD患者分为EOS 型（嗜酸性粒细胞百分比＞2.5%，中性粒细胞百分比≤61%）；NE 型（嗜酸性粒细胞百分比≤2.5%，中性粒细胞百分比＞61%）；AGR 型（嗜酸性粒细胞百分比≤2.5%，中性粒细胞百分比≤61%）；MIX 型（嗜酸性粒细胞百分比＞2.5%，中性粒细胞百分比＞61%）。

表1 诱导痰涂片评分标准

1.2.3 血常规及炎症因子检测 所有患者于入院后24 h内抽取空腹静脉血待检。采用全自动血细胞计数分析仪（型号：AU-680，贝克曼库尔特生物科技苏州有限公司）检测血常规；采用流式细胞仪（型号：FACSCalibur，美国BD 公司）检测血清活性氧（reactive oxygen species，ROS）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等氧化/抗氧化相关指标；采用ELISA 法检测IL-8、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）和TNF-α，严格按照说明书的操作步骤完成。

1.2.4 临床治疗方法及疗效评价 所有患者给予静脉滴注广谱抗生素[阿莫西林-克拉维酸针1.2 g，1 次/8 h（规格：1.2 g/支，批号：F6125508，华北制药股份有限公司）或哌拉西林舒巴坦钠针4.5 g，1 次/8 h（规格：4.5 g/支，批号：161203，苏州二叶制药有限公司）或莫西沙星针0.4 g，1 次/d（规格：0.4 g/250 ml/瓶，批号：BXHGJU3，拜耳先灵医药保健股份公司）]；并予雾化吸入支气管扩张剂。每天完成临床COPD 问卷（clinical COPD questionnaire，CCQ）评分，并记录患者急性加重期到恢复期（病情与加重期前的相似）的时间（症状恢复时间）、住院时间。疗效标准[5]：有效为CCQ 评分达到恢复期；失败为CCQ 评分未达到恢复期，规范使用抗生素7 d 后仍需要继续使用或需要更改抗生素。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0 统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐性时，两两比较采用LSD-t 检验；方差不齐时，两两比较采用Tamhane's T2 检验；计数资料组间比较采用χ2检验。采用Pearson 相关分析不同分型AECOPD 患者炎症因子水平与肺功能指标的相关性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AECOPD 患者分型结果 122 例AECOPD 患者中，EOS 型25 例，NE 型51 例，AGR 型35 例，MIX 型11 例。

2.2 不同分型AECOPD 患者外周血及诱导痰嗜酸性粒细胞百分比和中性粒细胞百分比比较 不同分型AECOPD 患者外周血及诱导痰嗜酸性粒细胞百分比和中性粒细胞百分比比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。进一步两两比较发现，NE 型及MIX 型患者外周血及诱导痰中性粒细胞百分比均高于EOS 型及AGR 型患者（均P＜0.05），而EOS 型及MIX 型患者外周血及诱导痰嗜酸性粒细胞百分比均高于NE 型及AGR 型患者（均P＜0.05），见表2。

表2 不同分型AECOPD 患者外周血及诱导痰嗜酸性粒细胞百分比和中粒细胞百分比比较（%）

2.3 不同分型AECOPD 患者肺功能指标比较 不同分型AECOPD 患者FEV1和FEV1/FVC 比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。进一步两两比较发现，NE型及MIX 型患者FEV1均低于EOS 型及AGR 型（均P ＜0.05），NE 型患者FEV1/FVC 均低于EOS 型、AGR 型及MIX 型（均P＜0.05），见表3。

表3 不同分型AECOPD 患者肺功能指标比较（%）

2.4 不同分型AECOPD 患者炎症因子比较 不同分型AECOPD 患者ROS、SOD、IL-8、GM-CSF 及TNF-α比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。进一步两两比较发现，NE 型及MIX 型患者血清ROS、IL-8、GMCSF 及TNF-α 水平均高于EOS 型及AGR 型，血清SOD 活性均低于EOS 型及AGR 型（均P＜0.05）；且NE型患者血清ROS 水平高于MIX 型，SOD 活性低于MIX 型（均P＜0.05），见表4。

2.5 不同分型AECOPD 患者炎症因子水平与肺功能指标的相关性分析 Pearson 相关分析显示，不同分型AECOPD 患者血清ROS、IL-8、GM-CSF 及TNF-α 水平与FEV1及FEV1/FVC 均呈负相关（均P＜0.05），血清SOD 活性与FEV1及FEV1/FVC 均呈正相关（均P＜0.05），见表5～6。

2.6 不同分型AECOPD 患者临床疗效比较 不同分型AECOPD 患者症状恢复时间、住院时间和药物治疗失败率比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。进一步两两比较发现，NE 型及MIX 型患者症状恢复时间、住院时间均长于EOS 型及AGR 型，治疗失败率均高于EOS 型及AGR 型（均P＜0.05），见表7。

3 讨论

COPD 发病原因或许和肺部的异常炎症反应有关[9]。研究显示COPD 以遍及气道、肺实质和肺血管的慢性炎症为特征，这种炎症反应常以中性粒细胞等炎症细胞在肺内浸润增多为主要表现[10]；另有研究显示，部分AECOPD 患者气道内的嗜酸性粒细胞也升高明显[3]，提示炎症反应可能是导致COPD 发生的重要原因[11-12]。本研究对不同分型AECOPD 患者炎症因子水平进行比较，结果提示AECOPD 患者中炎症因子可能在慢性肺损伤过程中起直接或间接作用，其结果与部分学者的研究一致[13-14]。另有研究发现，炎症因子IL-8与α1 抗胰蛋白酶可相互配合产生趋化活性，打破肺的免疫防御系统，加强炎症反应和细菌感染，并促进COPD 的发展[15]。此外IL-8、TNF-α、GM-CSF 等还可活化中性粒细胞并释放多种炎症介质，产生黏膜水肿、白细胞浸润及调节免疫反应等多种效应，同时这些炎症因子还与气道平滑肌增厚、气道持续损伤及气道重塑有关，并可能导致COPD 的发生[13-14]。本研究结果还发现氧化/抗氧化失衡在慢性肺损伤过程中也可能起到一定作用，这与倪涵晨等[16]的研究结果一致。倪涵晨等[16]认为除了炎症外，氧化/抗氧化平衡对COPD 的发病具有重要作用，ROS 包含超氧阴离子（O2-）、过氧化氢等氧化物，具有氧化作用，可对肺组织产生氧化损伤，已有研究证实，ROS 可通过多方面途径参与COPD 的发生、发展[17]。而SOD 可以通过清除O2-对肺组织起到保护作用[18]。由此可见，氧化/抗氧化失衡可直接损伤肺功能导致COPD 疾病的发生、发展[16]。

表4 不同分型AECOPD 患者炎症因子比较

表5 不同分型AECOPD 患者炎症因子水平与FEV1 的相关性分析

表6 不同分型AECOPD 患者炎症因子水平与FEV1/FVC 的相关性分析

表7 不同分型AECOPD 患者临床疗效比较

众所周知，尽早评估AECOPD 患者的疾病严重程度可为治疗提供重要参考依据[19]。临床上肺功能检查在COPD 的诊断、病情评估、预后及治疗反应等方面均有重要意义，但急性加重期检查结果也往往不够准确，甚至部分患者难以完成该检查，所以该时期不建议对患者进行肺功能检查[20]。近年来临床上应用痰诱导涂片技术评估AECOPD 疾病严重程度具有一定的价值，并为COPD 的诊断及其治疗提供了重要的参考价值[3-5]。该技术具有很好的准确性和可重复性，对气道疾病的诊断和鉴别诊断、药物疗效观察及其机制探讨有一定意义[21]，这种非侵入性定量定性检测气道炎症的方法安全、可靠、简便、不受病情限制、患者易于接受[3]。本研究对痰液进行诱导后涂片染色，并根据嗜酸性粒细胞百分比和中性粒细胞百分比进行分型，对不同分型患者肺功能指标进行分析，结果提示AECOPD 患者痰诱导中性粒细胞数量升高，与疾病的严重程度存在一定的关系，本研究结果与部分学者的研究一致[3，5]。因此在AECOPD 期间可用痰诱导涂片技术来评估病情严重程度，为尽早开展临床治疗提供参考。此外，本研究对不同分型AECOPD 患者的疗效观察发现，NE 型和MIX 型患者对治疗的反应性可能较差，部分患者使用抗生素需要超过7 d，对于这部分患者应尽早引起重视，尽早给予制定个性化治疗方案，使患者最大获益。

本研究优点在于属于前瞻性研究，对临床治疗有明确的指导意义；在AECOPD 期因各种原因导致肺功能检查缺失，可以考虑使用痰诱导涂片结果暂时代替肺功能来评估病情严重程度，为尽早开展临床治疗提供参考。本研究的不足之处在于样本量较少,对最终结果的有效性产生一定影响，因此有待于扩大样本量来进一步研究证实。

综上所述，根据痰诱导涂片结果对AECOPD 患者进行分型，其中NE 型和MIX 型COPD 患者的肺功能较差、氧化/抗氧化系统失衡较为严重、对治疗反应性较差。这种分型可为AECOPD 患者个性化治疗方案的制定提供参考。