多酶恒温核酸快速扩增技术在霍乱弧菌检测中的应用

李盛杰，江海涛

(南京晓庄学院 食品科学学院， 江苏 南京 211171)

0 引言

霍乱弧菌(Vibriocholera)是一种在虾、蟹等水生动物中广泛存在的革兰阴性菌，具有食源性致病风险[1，2].水产品中的霍乱弧菌被摄入人体后往往可引起肠道传染病，发病急、传染性强且病死率高，对人类健康的危害极大[3，4].因此，在水产养殖过程中，提高霍乱弧菌快速、高效的检测手段，对于保障食品质量安全，维护人民生命健康，加强公共卫生防疫方面具有极其重要的意义.目前，针对霍乱弧菌检测的方法虽然很多，包括免疫检测法、生化鉴定法、实时荧光聚合酶链式反应、环介导恒温扩增(LAMP)等方法，但这些方法均无法同时解决操作烦琐耗时长、检测效率与检测灵敏度低、检测目标单一等问题[5-7].

多酶恒温核酸快速扩增技术(Multi-enzyme Isothermal Rapid Amplification，MIRA)的基本原理是在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体，在辅助蛋白和单链结合蛋白的帮助下，侵入双链DNA模板；在侵入位点形成D-loop区域，并开始对DNA双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体Rec/ssDNA解体的同时，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸，这个过程迅速高效地循环，从而完成目的片段超快速扩增.MIRA依靠多种功能蛋白在常温下同时作用，实现核酸的快速扩增，是能够真正实现便携式的现场快速核酸检测技术.整体反应时间短，仅为5～20 mins，设备需求低，反应温度为25～42 ℃，后续可以开发为荧光检测、胶体金试纸等快检手段.霍乱弧菌外膜蛋白ompW基因是霍乱弧菌菌株鉴定中常用的特异性检测基因，全长654 bp.因此，本研究针对该基因设计多组合引物，并对相关引物在多酶恒温核酸快速扩增中的特异性和灵敏度进行评价.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

霍乱弧菌基因组DNA和ompW基因质粒(潍坊安普未来生物科技有限公司)、琼脂糖(Sigma公司)、DNA提取试剂盒(诺唯赞生物科技股份有限公司)、DNA Marker及显色剂(诺唯赞生物科技股份有限公司)、MIRA扩增试剂盒(潍坊安普未来生物科技有限公司).

1.2 仪器

PCR扩增仪(T100TM，Bio-rad生命医学产品有限公司)、凝胶成像系统(SH-520，杭州申花科技有限公司)、电泳仪(JY300C，北京君意东方电泳设备有限公司)、水平电泳槽(JY-SPCT，北京君意东方电泳设备有限公司).

1.3 试验方法

1.3.1 引物设计

结合霍乱弧菌ompW基因的保守序列，采用引物设计软件Primer Premier 5.0对引物进行设计，委托广州擎科生物技术有限公司进行合成，具体序列见表1.

表1 引物信息

1.3.2 扩增方法

按照MIRA扩增试剂盒操作流程，每个干粉反应管加入29.4 μL bufferA，然后每个反应管分别加入2 μL上游引物和2 μL下游引物；向反应管中依次加入9.1 μL ddH2O和5 μL核酸模板，然后向反应管中加入2.5 μL BufferB并充分混合；混匀后，将反应液甩至管子底部，立即将反应管放入恒温设备中37 ℃孵育30 mins；反应结束后，加入50 μL酚/氯仿抽提反应溶液，12000 rpm离心5 min，取5～8 μL上清进行琼脂糖电泳检测.

1.3.3 特异性评价

利用ompW基因质粒作为模板，对6对引物的特异性进行检测，并评价所设计引物对的特异性.

1.3.4 灵敏度评价

分别将ompW基因质粒和提取的霍乱弧菌基因组DNA作为模板，按10倍稀释为不同浓度的模板.按照MIRA扩增方法进行引物的灵敏度测试.

2 结果与分析

2.1 不同引物对ompW基因的特异性评价

按照MIRA扩增方法，用ompW基因质粒作为模板，浓度为10 fg/μL，上样量为5 μL，对6对引物组进行扩增实验(图1).实验结果表明，第1、2组条带比较清晰干净.因此，优先选择ompW-2-F1+ompW-2-R1和ompW-2-F1+ompW-2-R2两组引物进行后续实验.

图1 不同引物对ompW基因的特异性检测结果

2.2 不同引物对ompW基因的灵敏度评价

通过上述实验结果，我们选择ompW-2-F1+ompW-2-R1和ompW-2-F1+ompW-2-R2两组引物进行灵敏度评价.通过ompW基因质粒作为模板，每一组引物均设置10 fg/μL、1 fg/μL、0.1 fg/μL三个不同的模板浓度，进行扩增实验(图2).结果表明，引物对ompW-2-F1+ompW-2-R2在1fg/μL的模板浓度时，扩增条带比引物对ompW-2-F1+ompW-2-R1显著清晰.

图2 两组不同引物对ompW质粒的灵敏度检测

为进一步验证引物对ompW-2-F1+ompW-2-R2对ompW基因的灵敏度，我们利用霍乱弧菌提取的核酸作为模板，10 ng/μL按10倍稀释为7个不同浓度的模板进行验证(图3).结果表明，该引物对在模板稀释至100 fg/μL浓度时有清晰明亮的条带，稀释至10 fg/μL时有微弱条带，具有较好的检测灵敏度.

图3 引物对霍乱弧菌核酸的扩增灵敏度检测

3 讨论

通过多酶恒温核酸快速扩增体系，我们对全部6对引物组合进行了初筛，结果显示ompW-2-F1+ompW-2-R1和ompW-2-F1+ompW-2-R2这两对引物的条带最清晰干净；选择以上两对引物进行质粒的浓度梯度实验筛选，两对引物均在1 fg/μL浓度时有清晰明显条带，其中ompW-2-F1+ompW-2-R2的条带更为明亮，且在0.1 f g/μL浓度时有微弱条带；最后我们通过霍乱弧菌核酸进行检测，模板稀释在至10 fg/μL浓度时仍有微弱条带，表现出较好的检测灵敏度.综上判断，我们认为ompW-2-F1+ompW-2-R2这对引物具备较好的特异性和灵敏度，不仅可以进行霍乱弧菌的快速检测，也可利用该对引物进行后续的胶体金试纸条的开发实验.