淫羊藿苷对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化易损斑块细胞凋亡和Nrf2/ARE通路的影响

徐永艳，苏 明，方笑涵，刘 畅，刘芃菲，赵晓涛(北京大学人民医院检验科，北京 100044)

动脉粥样硬化是多种心脑血管疾病的病理基础，以动脉内膜增厚、脂质沉积、粥样斑块形成为特点，其中易损斑块容易发生破裂并诱导血栓形成，与心肌梗死、脑梗死等心脑血管事件的发病密切相关[1-3]。血管平滑肌细胞的过度凋亡与凋亡基因中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3)的表达水平上升有关[4-5]。核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反应元件(anti-oxidative response element，ARE)通路是在心脑血管疾病中起重要作用的抗氧化通路，其也在细胞凋亡中起调控作用[6]。淫羊藿的有效成分淫羊藿苷具有保护作用，在肝脏、肾脏中均通过激活Nrf2/ARE通路减轻不同病理因素引起的组织损伤[7-8]。本研究将在载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)-/-小鼠动脉粥样硬化易损斑块模型中研究淫羊藿苷对细胞凋亡及Nrf2/ARE通路的调控作用。

1 仪器与材料

1.1仪器 正置显微镜(日本Nikon公司)；凝胶电泳仪及成像仪(美国Bio-rad公司)。

1.2试药 淫羊藿苷(美国Sigma公司)；HE检测试剂盒、TUNEL检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；Bax、Bcl-2、Caspase-3、Nrf2和ARE一抗均购自Abcam公司；MDA、8-OHdG和TAC检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3动物 24只SPF级ApoE-/-小鼠[雄性、18～20 g，许可证SCXK(京)2016-0011]，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

2 方法

2.1动物分组、造模及给药 将ApoE-/-小鼠随机分为对照组、模型组和淫羊藿苷组，每组各8只。全部小鼠均腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，做颈正中切口、分离颈总动脉，对照组不进行其他操作，模型组和淫羊藿苷组在动脉周围植入内径0.3 mm的硅胶管，用6-0丝线固定，关闭切口。手术后，对照组给予普通饲料喂养及0.5 mL生理盐水灌胃，1日1次，模型组给予高脂饲料喂养及0.5 mL生理盐水灌胃，1日1次，淫羊藿苷组给予高脂饲料喂养及100 mg·kg-1淫羊藿苷灌胃，1日1次。12周后进行取材及检测。

2.2血管病理改变的HE检测 取小鼠右侧颈总动脉，用石蜡包埋后制做病理切片，采用HE检测试剂盒进行染色，按照试剂盒说明书进行操作，在显微镜下观察血管的病理改变。

2.3血管平滑肌细胞凋亡的TUNEL检测 取右侧颈总动脉的病理切片，采用TUNEL法试剂盒进行染色，按照试剂盒说明书进行操作，在显微镜下观察TUNEL阳性细胞数及总细胞数，计算比值作为细胞凋亡率。

2.4Western blot检测 取小鼠右侧颈总动脉，加入裂解液后进行匀浆，匀浆液在4 ℃条件下，以12 000 r·min-1离心10 min，分离上清进行Western blot检测。在聚丙烯酰胺凝胶内进行电泳，而后电转移至硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，NC)，NC在室温下封闭。继而经一抗孵育(4 ℃)、二抗孵育(室温)后在凝胶成像仪内进行显影，得到目的蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、Nrf2、ARE及内参蛋白β-actin的条带，将目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值作为蛋白表达水平。

取右侧颈总动脉匀浆后的离心上清液，采用试剂盒检测MDA、8-OHdG和TAC的水平，按照试剂盒说明书进行操作。

3 结果

3.13组小鼠血管病理改变的比较 如图1所示，对照组小鼠颈动脉的血管壁光滑，未出现粥样斑块；模型组小鼠颈动脉血管壁内可见斑块沉积，且斑块内脂质较大、斑块结构不稳定；淫羊藿苷组小鼠颈动脉血管壁内斑块缩小且结构趋于稳定。

图1 3组小鼠血管病理改变的比较(HE染色，×10)Fig.1 Comparison of vascular pathological changes among the 3 groups of mice (HE staining，×10)

3.23组小鼠血管平滑肌中细胞凋亡的比较 如图2所示，对照组小鼠血管平滑肌细胞未见明显凋亡，模型组和淫羊藿苷组小鼠血管平滑肌细胞的凋亡率分别为14.59%±3.23%和6.51%±1.59%。与对照组比较，模型组小鼠血管平滑肌中细胞凋亡率明显升高(P<0.05)；与模型组比较，淫羊藿苷组小鼠血管平滑肌中细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。

图2 3组小鼠血管平滑肌中细胞凋亡的比较(TUNEL染色，×100)Fig.2 Comparison of apoptosis in vascular smooth muscle among the 3 groups (TUNEL staining，×100)

3.33组小鼠血管平滑肌中凋亡基因表达水平的比较 如图3、表1所示，与对照组比较，模型组小鼠血管平滑肌中Bax、Caspase-3的表达水平明显升高，Bcl-2的表达水平明显降低(P<0.05)；与模型组比较，淫羊藿苷组小鼠血管平滑肌中Bax、Caspase-3的表达水平明显降低，Bcl-2的表达水平明显升高(P<0.05)。

表1 3组小鼠血管平滑肌中Bax、Bcl-2和Caspase-3表达水平的比较Tab.1 Comparison of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 expression in vascular smooth muscle among the 3 groups of mice

图3 3组小鼠血管平滑肌中Bax、Bcl-2和Caspase-3表达水平的Western blot检测Fig.3 Results of Western blot detection of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 expression in vascular smooth muscle of the 3 groups of mice

3.43组小鼠血管平滑肌中氧化应激指标的比较 如表2所示，与对照组比较，模型组小鼠血管平滑肌中MDA、8-OHdG的水平明显升高，TAC的水平明显降低(P<0.05)；与模型组比较，淫羊藿苷组小鼠血管平滑肌中MDA、8-OHdG的水平明显降低，TAC的水平明显升高(P<0.05)。

表2 3组小鼠血管平滑肌中MDA、8-OHdG和TAC的比较Tab.2 Comparison of MDA，8-OHdG and TAC in vascular smooth muscle among the 3 groups of mice

3.53组小鼠血管平滑肌中Nrf2/ARE通路的比较 如图4、表3所示，与对照组比较，模型组小鼠血管平滑肌中Nrf2、ARE的表达水平明显降低(P<0.05)；与模型组比较，淫羊藿苷组小鼠血管平滑肌中Nrf2、ARE的表达水平明显升高(P<0.05)。

图4 3组小鼠血管平滑肌中Nrf2、ARE表达水平的Western blot检测结果Fig.4 Results of Western blot detection of Nrf2 and ARE expression in vascular smooth muscle of the 3 groups of mice

表3 3组小鼠血管平滑肌中Nrf2、ARE表达水平的比较 Tab.3 Comparison of Nrf2 and ARE expression in vascular smooth muscle among the 3 groups of mice

4 讨论

动脉粥样硬化的特征是脂质在血管壁沉积，引起巨噬细胞吞噬并泡沫化、促进血管平滑肌细胞增殖和迁移。当动脉粥样斑块形成后，斑块内脂质及纤维帽均会发生变化，斑块内脂质核心增大、斑块纤维帽变薄导致易损斑块的形成，容易发生斑块破裂并引起血栓形成，进而造成心肌梗死、脑梗死等急性心脑血管事件的发生。因此，易损斑块的临床危害大，需要积极防治。近年关于易损斑块形成的研究认为，细胞凋亡是与斑块稳定性下降密切相关的生物学环节，血管平滑肌细胞的过度凋亡会造成斑块内形成坏死核心、引起斑块纤维帽变薄，最终造成易损斑块的形成[4-5]。本研究从细胞凋亡的角度分析易损斑块的防治手段。

ApoE在脂质代谢中起关键作用，敲除ApoE后给予高脂喂养是建立动脉粥样硬化模型的常用方法。王南丁等[9]的实验是在敲除ApoE及高脂喂养的基础上采用PCCP建立易损斑块模型，本研究采用与王南丁等[9]相同的方法建立易损斑块模型，通过HE染色观察血管病理改变可知，动脉壁内脂质斑块沉积且斑块内脂质核心较大、斑块结构不稳定，符合易损斑块的特征；通过TUNEL染色证实，模型组小鼠血管平滑肌出现了显著的细胞凋亡，表明血管平滑肌细胞凋亡与易损斑块的形成有关。

淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等生物学作用。多项心血管疾病相关的研究证实，淫羊藿苷在心肌缺血再灌注损伤及内皮细胞氧化应激损伤过程中起抗凋亡的作用，能够调控Bax和Bcl-2的表达，从而抑制线粒体途径细胞凋亡[10-12]。Bax和Bcl-2在Caspase-3表达中分别起促进和抑制作用，进而能够分别发挥抗凋亡和促凋亡的作用[13-14]。本研究在易损斑块模型小鼠中检测了线粒体途径凋亡基因的表达后发现，Bax、Caspase-3的表达水平明显升高，Bcl-2的表达水平降低，表明在易损斑块的形成过程中线粒体途径凋亡发生了过度激活。在易损斑块造模过程中给予淫羊藿苷灌胃干预后，小鼠血管平滑肌中的细胞凋亡率降低，促进线粒体途径凋亡的Bax、Caspase-3的表达水平也下降，抑制线粒体途径凋亡的Bcl-2表达水平升高，表明将淫羊藿苷用于易损斑块的治疗能够抑制线粒体途径细胞凋亡。

在心血管疾病的发病过程中，平滑肌细胞凋亡、内皮细胞凋亡的调控与氧化应激有关，自由基大量生成，一方面引起细胞的氧化损伤，造成MDA、8-OHdG等氧化产物的生成量增多[15-16]；另一方面通过调控下游NF-κB等途径引起细胞凋亡[17-18]。本研究对易损斑块形成过程中氧化应激的分析显示，MDA、8-OHdG的水平升高，TAC的水平降低；淫羊藿苷干预后，MDA、8-OHdG的水平降低，TAC的水平升高。这一结果表明氧化应激与易损斑块的形成有关，淫羊藿苷对氧化应激具有抑制作用。Nrf2/ARE通路是重要的抗氧化通路，同时也具有抗凋亡作用[19-20]，本研究证实淫羊藿苷使易损斑块模型小鼠血管平滑肌中Nrf2、ARE的表达量增加，提示淫羊藿苷的抗凋亡及抗氧化作用与激活Nrf2/ARE通路有关。

综上所述，淫羊藿苷能够改善ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化易损斑块，这与抑制细胞凋亡及Nrf2/ARE通路有关，未来淫羊藿苷有望成为防治易损斑块、治疗心脑血管疾病的潜在药物。