基于网络药理学和分子对接探讨桔梗-甘草防治COVID-19的机制

马英华，张古英，赵宜乐，韩 雨，姜锡娟，解伟伟，安 娜，安志华，秦亚彬 (.河北省儿童医院药学部，石家庄 05003；.河北医科大学第二医院药学部，石家庄 050000)

在抗击新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease 2019，COVID-19)时[1]，中医药与西药相辅相成，做出了巨大贡献[2-3]。桔梗为桔梗科植物桔梗[Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.]的干燥根[4]。甘草为豆科植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)、胀果甘草(GlycyrrhizainflataBat.)或光果甘草(GlycyrrhizaglabraL.)的干燥根和根茎[5]。桔梗和甘草配伍，最早来源于中医经典《伤寒论》中的桔梗汤，主要用于治疗肺热咽痛、肺热咳嗽、肺痈等证[6]。桔梗-甘草药对经加味可以演化为清金化痰汤、托里消毒散、清肺汤等经典名方[7-8]。同时，桔梗和甘草是在COVID-19的治疗中高频次出现的中药[9]。但桔梗-甘草药对干预COVID-19的作用机制尚不明确。

网络药理学从系统整体角度出发，对生物系统的网络信号进行多成分-多靶点的系统研究，广泛应用于中药研究中，而分子对接更能从药物分子设计的角度佐证网络药理学的研究结果[10-11]。本研究基于网络药理学和分子对接技术，探讨并验证桔梗-甘草药对干预COVID-19的作用机制，以期为治疗COVID-19提供理论支持。

1 资料与方法

1.1活性成分和靶点筛选 利用TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)数据库，检索关键词“桔梗”和“甘草”，以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug likeness，DL)≥0.18为筛选条件，筛选出药效活性成分。同时预测成分潜在作用靶点，利用蛋白质数据库Uniprot(https://www.uniprot.org/)和perl脚本程序对靶点基因的名称进行转换，校正为官方的缩写名称。

1.2疾病靶点筛选 利用基因数据库Gene Cards(https://www.genecards.org)、OMIM(https://www.omim.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)，对关键词“COVID-19”和“novel coronavirus”进行检索，限定选择相关度≥1的靶点，收集疾病靶点。

1.3药物-成分-靶点网络构建 安装R语言软件R×64 4.0.2，在R语言上安装Venny 2.1.0，将药物与疾病靶点取交集绘制韦恩图，得到交集靶点文档，并运用Cytoscape 3.7.2软件绘制相互作用网络图。

1.4PPI网络构建 使用STRING(https://string-db.org/)网站，将1.3项下得到的交集靶点导入数据库，物种限定为“Homo sapiens”，设置最低相互作用阈值“medium confidence”为0.7，隐藏离散点，得到PPI网络图，结果以tsv的格式导出，备用。将这些数据导入Cytoscape软件进行可视化，运用CytoNCA插件对交集基因进行打分筛选，得到核心基因。

1.5通路富集分析 使用perl脚本，将交集靶点的symbol 转换为基因ID，再次使用R语言软件，安装Bioconductor数据库安装包，对交集靶点进行GO(gene ontology)分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析，最终得到GO分析的柱形图、KEGG通路分析的气泡图和通路途径图。

1.6活性分子与靶点蛋白对接 从PubChem(https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中下载活性成分(Degree≥11)的二维化学结构，利用Chem Office 3D 18.1.0软件转换为三维结构，转码为mol2格式文件，备用。从RCSB PDB(http://www.rcsb.org/)数据库下载Mpro(PDB ID：6LU7)和ACE2(PDB ID：1R42)的3D结构，应用PyMOL软件进行去水分子和去有机物操作，备用。将上述活性化合物和蛋白结构文件导入AutoDock Tools 1.5.6软件进行优化操作，设置蛋白活性口袋，定义盒子大小为(40×40×40)个网格点，每个网格点的距离(spacing)为1.0 nm，最后利用AutoDock Vina软件进行分子对接。

2 结果

2.1活性成分和靶点筛选 在TCMSP数据库中查询桔梗和甘草的成分，共收集到367种化学成分(桔梗102种，甘草265种)，设置参数(OB≥30%，DL≥0.18)进行筛选，结果共筛选得到99种成分(桔梗7种，甘草92种)。同时，利用TCMSP数据库筛选桔梗和甘草成分所对应的靶点基因，共获得2 766个靶点。

2.2疾病靶点筛选 在数据库Gene Cards、OMIM、TTD、PharmGkb和DrugBank中，以“COVID-19”和“novel coronavirus”为搜索词，得到与COVID-19相关的靶点，设置相关度≥1，去重取并集，共获得674个靶点。在R语言软件中运行脚本进行韦恩图绘制，对交集结果进行可视化，见图1A，其中GeneCard 482个、OMIM 3个、TTD 100个、PharmGkb 9个、DrugBank 119个。

2.3活性成分-关键靶点相互作用网络分析 利用R语言软件，绘制成分-靶点的韦恩图，得到交集基因67个，见图1B，并应用Cytoscape 3.7.2软件进行网络构建和可视化，见图2。圆形表示靶点，长方形表示甘草有效成分，倒三角形表示桔梗有效成分，连线表示二者之间的相互作用关系。如图2所示，共有150个节点(83种成分和67个交集基因)和672条连线，此结果体现了中药多成分多靶点共同作用的意义。根据拓扑学分析，该网络中所有靶点按度值(Degree)打分排序，靶点节点大小用“Degree”表示，得到靶点的得分排序。度值越大表示靶点被越多的有效成分所靶向，说明靶向靶点对蛋白相互作用网络的关键作用。而大于平均度值的交集基因有10个，分别为PTGS2(78)、ESR1(71)、NOS2(62)、PPARG(58)、GSK3B(53)、CDK2(53)、CCNA2(50)、MAPK14(43)、PTGS1(41)和DPP4(35)。

图1 来自5个数据库的靶点韦恩图注：A.COVID-19疾病靶点韦恩图；B.桔梗-甘草药对与COVID-19交集靶点韦恩图。Fig.1 Target Venn diagrams from 5 databasesNotes：A.Venn diagram of COVID-19 disease targets；B.Venn diagram of intersection targets in Platycodonis Radix-Licorice drug pair and COVID-19 disease.

图2 药物-成分-靶点相互作用网络Fig.2 Drug-component-target interaction network

2.4PPI网络构建及查找核心基因 将67个交集基因导入STRING数据库，设置物种为人类，剔除离散靶点，筛选得分大于0.7的靶点，最终得到PPI网络的关系数据，将数据导入Cytoscape软件构建蛋白相互作用网络图(图3A)。运用CytoNCA插件对交集基因进行打分，筛选依据为中介中心性(betweenness centrality，BC)、紧密中心性(closeness centrality，CC)、程度中心性(degree centrality，DC)、特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)、本地平均水平连接性(local average connectivity，LAC)和网络中心性(network centrality，NC)，若6项的评分均大于中位数，则将该基因保留，否则将其剔除(图3B)。最后经过2轮筛选，得到核心基因(图3C)。最终核心基因包括RELA、STAT1、MAPK3、TP53、MAPK1、MAPK8、STAT3、MAPK14、IL1B和TNF(详细节点参数见表1)。结果表明，桔梗-甘草药对可能通过以上核心基因干预COVID-19的进展。同时，将2.3项下的主要作用靶标与PPI网络的核心基因取交集，得到MAPK14基因，可以推测MAPK14基因不仅对药材和疾病作用的影响大，而且在PPI网络中居于重要地位，推断这个靶点可能是桔梗-甘草药对拮抗新型冠状病毒的重要靶标。

图3 使用Cytoscape软件构建的PPI网络图注：A.使用CytoNCA插件第一次过滤筛选出的各评分均高于中位数的倒三角节点；B.通过CytoNCA插件第二次过滤构建的子网络；C.最后使用CytoNCA插件2次筛选得到的核心基因。Fig.3 Establishing PPI network by using CytoscapeNotes:A.CytoNCA plug-in was used to filter out the yellow nodes whose scores were higher than the median for the first time；B.subnetwork constructed by a second filtration via CytoNCA；C.final core genes screened after two filtrations by using CytoNCA.

表1 蛋白相互作用网络核心靶点蛋白拓扑参数Tab.1 Topological parameters of core target proteins in PPI network

2.5GO富集分析和KEGG通路分析 经分析，共获得2 120个生物过程(biological process，BP)、38种细胞组分(cellular component，CC)和136个分子功能(molecular function，MF)，筛选各组分前10个富集最显著的GO分析(图4)，其中BP主要与抗氧化反应、细胞对化学压力的反应、凋亡信号通路的调控、对脂多糖的反应和对细菌起源分子的反应等相关，CC 主要集中在细胞膜活性上，而MF主要与细胞因子活性和受体结合相关。以上结果提示桔梗-甘草药对的靶点主要与细菌和病毒感染等密切相关。通过KEGG通路分析，共获得166条信号通路，选取前30条富集最显著的通路绘制气泡图，见图5，其中x轴表示富集因子(rich factor)，即背景基因集中在这个通路的所有基因的数量，y轴表示通路名称，气泡颜色表示P值大小，气泡大小表示基因数量。如图5所示，富集通路涉及Coronavirus disease-COVID-19通路，涉及的其他通路大致可分为免疫反应相关通路、炎症相关通路、抑制病毒感染通路和抑制癌症的相关通路。以上结果提示桔梗-甘草药对可能通过干预这些信号通路来抑制COVID-19的进展。

图4 桔梗-甘草药对干预COVID-19的GO富集分析结果Fig.4 GO enrichment analysis of Platycodonis Radix-Licorice drug pair for intervention against COVID-19

图5 桔梗-甘草药对干预COVID-19的KEGG富集分析结果Fig.5 KEGG enrichment analysis of Platycodonis Radix-Licorice drug pair for intervention against COVID-19

2.6核心活性成分与ACE2和Mpro的分子对接 分子对接技术通过计算机辅助药物设计对主要活性成分与疾病关键靶点蛋白进行模拟研究，从而简单验证网络药理学的分析结果，其结合自由能越小，则配体与受体的亲和力越大，从而侧面佐证活性成分与关键靶点存在相互作用。一般结合自由能小于-5.0 kcal·mol-1则认为模拟成功，小于-7.0 kcal·mol-1则认为两者有较好的结合能力。将网络药理学分析中得到的前11种活性成分(Degree≥11)分别与ACE2和Mpro进行对接，计算结合自由能，采用最小的结合构象，结果见表2。同时，自由能最小的前4种活性化合物(鳞叶甘草素A、槲皮素、甘草查尔酮A和木犀草素)的分子对接图见图6。

表2 核心活性成分与SARS-CoV-2的结合位点Mpro和ACE2分子对接效能Tab.2 Molecule docking efficiency of core active components with Mpro and ACE2 at the binding sites of SARS-CoV-2

图6 活性成分与ACE2和Mpro的分子对接模式Fig.6 Molecular docking diagram of active ingredients with ACE2 and Mpro

3 讨论

目前对于COVID-19缺乏特效治疗药物，根据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第8版)》(国卫办函)，治疗以抗病毒、抗感染、免疫治疗和对症治疗为主。在中医理论背景下[12]，COVID-19属于中医疫病范畴[13]，其病因主要是感受“疫戾”之气，病理因素主要以湿为主，伴随毒和瘀，入肺化热，所以初期治疗以清热解毒化湿为主[14]。从古至今，中医药在各种瘟疫病的治疗中都发挥着重要作用[15]。经典药对桔梗和甘草合用，对COVID-19有一定的防控作用。但是，其对COVID-19的治疗作用尚缺乏直接证据。

本研究采用网络药理学结合分子对接技术系统分析了经典药对桔梗-甘草干预COVID-19的潜在作用机制。从现存的中药数据库中获得靶标信息，筛选出99种活性成分，并与COVID-19疾病靶标取交集，获得67个交集靶点，通过对关键交集靶点进行PPI网络分析和筛选，得到关键靶点MAPK14。MAPK14，即p38α，是p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)家族成员之一[16]。MAPK14作为MAPK家族中的重要成员之一，其表达与机体生理功能密切相关，表达异常可引发机体免疫功能失调，导致许多疾病的发生，同时也与炎症反应息息相关。当机体受到不同理化因素、炎性因子、脂多糖、紫外线照射等刺激后，可通过活化MAPK14蛋白来激活p38MAPK通路，从而启动炎症级联反应[17]。因此，推测桔梗-甘草药对可能通过调控MAPK14蛋白的表达而起到抑制病毒的作用。通过对关键交集靶点进行GO富集分析发现，其BP主要与抗氧化反应、细胞对化学压力的反应、凋亡信号通路的调控、对脂多糖的反应、对细菌起源分子的反应密切相关，表明桔梗-甘草药对可能具有抗病毒和抗感染的作用。而KEGG通路分析结果则显示桔梗-甘草药对干预COVID-19的通路大致可以分为免疫反应相关通路、炎症相关通路、抑制病毒感染通路和抑制癌症的相关通路，该结果提示桔梗-甘草药对可能通过多渠道、多通路抑制COVID-19的进展。

新型冠状病毒于2020年2月11日被国际病毒分类委员会命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。研究发现，SARS-CoV-2与严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome-coronavirus，SARS-CoV)、中东呼吸系统综合征冠状病毒(middle east respiratory syndrome-coronavirus，MER-SCoV)一样，同属于β属的冠状病毒[18-19]，2019-nCoV与SARS-CoV的基因序列同源性高达79%，与MER-SCoV序列的同源性也达到了40%左右，且三者都是通过刺突糖(spike glycoprotein，S)蛋白的表达与人体黏膜上皮细胞膜表面的ACE2的受体结合而入侵机体，继而大量复制，导致肺炎[20-21]。而ACE2作为炎症因子调节蛋白[22]，通过酪氨酸蛋白磷酸化，激活MAPK受体，诱导激活促炎因子，导致线粒体功能障碍，从而损害组织细胞[23]。因此，活性成分与Mpro和ACE2的靶点结合能有效抑制病毒的进一步入侵，从而减轻病毒感染的程度。目前，利用分子对接技术模拟、验证活性成分与病毒靶点的结合，初步筛选出能与化学抗病毒药物相匹敌的活性成分，为进一步的实验验证奠定了理论基础，也为这些活性成分能够成为抗病毒药提供了理论依据，既减少实验资源的盲目浪费，又为进一步的实验研究奠定了基础。

综上所述，中药经典药对桔梗-甘草干预COVID-19是通过多成分、多靶点、多通路的协同方式实现，为COVID-19的中医防治提供了可行性理论参考。同时，通过分子对接分析药对的核心成分，也为新药的开发提供了新方向，缩短了用于筛选有效化合物的时间，提高了新药开发的效率。但是本研究也存在一定的局限性，即预测的理论结果还需后期的实验进行进一步验证，才能为COVID-19的中医防治提供更可靠的理论和数据支持。