ABCG2抑制剂对ALA-PDT诱导皮肤癌细胞凋亡的影响

柳喜凤，张东晨(.河北省保定市第一中心医院公共卫生科，保定 07000；2.河北省保定市第一中心医院皮肤科，保定 07000)

皮肤癌是临床常见疾病，在长期受到紫外线照射或吸烟人群中的发病率较高[1]。皮肤癌的长期进展会影响患者的外貌，还导致患者病死率升高，严重影响患者的生活质量[2]。手术治疗能显著提高皮肤癌患者的生存率，但对于肿瘤病灶大、位置特殊的患者，术后创伤形成的瘢痕会给患者带来强烈的精神痛苦[3]。5-氨基乙酰丙酸(5-aminolaevulinic acid，5-ALA)是新一代的光敏感剂，可导致细胞中原卟啉IX(protoporphyrin IX，PPIX)蓄积[4]。光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)是一种以光、光敏剂和氧分子相互作用为基础的非侵袭性治疗技术，可选择性破坏靶细胞、组织，还具有一定美容效果[5]。研究发现，病变部位PPIX的蓄积是影响ALA-PDT疗效的重要因素[6]。而三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ATP-binding cassette transporter group 2，ABCG2)可调节内源性PPIX水平，过度表达会引起胞内PPIX水平降低[7]。ABCG2抑制剂可恢复三阴性乳腺癌细胞对ALA-PDT的敏感性[8]。但ABCG2抑制剂对ALA-PDT治疗皮肤癌的影响尚鲜有研究。本研究将探讨ABCG2抑制剂Ko-143对ALA-PDT诱导不同皮肤癌细胞凋亡的影响，以期为提高ALA-PDT对皮肤癌的疗效提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 恒温培养箱(型号TY10GI2-2，美国Shellab公司)；酶标仪(型号Stat Fax-2100，美国Awareness公司)；流式细胞仪(型号Guauasoft 6L，美国Millipor公司)；凝胶成像仪(型号GelDocEZ，美国Bio-Rad公司)。

1.2试药 人皮肤基底癌细胞TE354.T、人皮肤鳞癌细胞SCL-1(货号HTX2117C、HTX2657C，深圳市豪地华拓生物科技有限公司)；5-ALA(货号YJ3004833，上海一基实业有限公司)；ABCG2抑制剂Ko-143(货号A11475，美国Adooq Bioscience公司)；RPMI-1640培养液(货号CP680110A，上海冠导生物工程有限公司)；MTT试剂盒(货号M1020，北京索莱宝科技有限公司)；Annexin-V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(货号SNM530-FNI)，谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)检测试剂盒(货号ARB10949)，丙二醛(malonydialdehyed，MDA)检测试剂盒(货号ARB12124)，均购自北京百奥莱博科技有限公司；PPIX抗体(货号ab235595)，ABCG2抗体(货号ab229193)，B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗体(货号ab32124)，Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗体(货号ab182734)，活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3)抗体(货号ab49822)，GAPDH抗体(货号ab59164)，羊抗兔lgG(货号 ab205718)，均购自Abcam公司。

2 方法

2.1细胞培养 TE354.T、SCL-1细胞解冻复苏后，培养于含质量浓度为1 g·L-1胎牛血清的RPMI-1640培养液中，培养皿放在37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱中，1～2 d更换1次培养液，待细胞覆盖培养皿底部80%左右时，用质量浓度为0.025 g·L-1的胰酶消化成单个细胞传代，取对数期细胞进行后续实验。

2.2MTT法检测TE354.T和SCL-1细胞增殖 取对数期TE354.T、SCL-1细胞，使用培养液将细胞悬液的密度调整为1×105个·mL-1，以每孔100 μL细胞悬液接种于96孔培养板。设置对照组、ALA-PDT组、Ko-143组和ALA-PDT+Ko-143组，每组6个复孔。对照组细胞不进行干预；ALA-PDT组细胞加入终浓度为2 mmol·L-1的5-ALA，避光孵育4 h，进行光照密度为10 J·cm-2(20 mW·cm-2，500 s)的PDT处理[9]；Ko-143组加入终浓度为10 μmol·L-1的ABCG2抑制剂Ko-143[10]；ALA-PDT+Ko-143组加入终浓度为2 mmol·L-1的5-ALA及终浓度为10 μmol·L-1的Ko-143，避光孵育4 h，进行光照密度为10 J·cm-2(20 mW·cm-2，500 s)的ALA-PDT处理。处理结束后放回培养箱中再孵育20 h，每孔加入3-(4，5)-2-噻唑-(2，5)-二苯基溴化四氮唑蓝[3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]10 μL，放回培养箱中继续孵育4 h，弃去培养液，每孔加二甲基亚砜(dimethylsurfoxide，DMSO) 150 μL，避光振荡溶解，测定各孔450 nm处的吸光度(A)，计算增殖抑制率。增殖抑制率=[(A对照组-A实验组)/A对照组]×100%。

2.3流式细胞术检测TE354.T和SCL-1细胞凋亡 取对数期TE354.T、SCL-1细胞，使用培养液调整细胞悬液的密度为1×105个·mL-1，以每孔500 μL细胞悬液接种于24孔培养板，按2.2项下方法对细胞进行分组和处理。处理结束后，放回培养箱中孵育20 h，收集细胞，经胰酶消化后洗涤。将Annexin-VFITC、PI和结合缓冲液按1∶2∶50配制成Annexin-V-FITC/PI染液，使用Annexin-V-FITC/PI染液将细胞重悬，使其成为密度为1×107个·mL-1的细胞悬液，室温避光孵育15 min，在流式细胞仪上样，检测细胞凋亡率。

2.4ELISA法检测TE354.T和SCL-1细胞中的GSH-Px活性、MDA含量 取对数期TE354.T、SCL-1细胞，使用培养液将细胞悬液的密度调整为1×105个·mL-1，以每孔500 μL细胞悬液接种于24孔培养板，按2.2项下方法进行分组和处理。处理结束后，放回培养箱中孵育20 h。收集细胞，经消化后洗涤，在冰上将细胞制成匀浆后离心，取上清，参照ELISA试剂盒说明书中步骤，测定450 nm处各组样品与标准物的A值，用标准物浓度及相应A值绘制标准曲线，计算TE354.T、SCL-1细胞中GSH-Px的活性和MDA的含量。

2.5蛋白印迹法检测TE354.T和SCL-1细胞中PPIX、ABCG2、Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表达 取对数期TE354.T、SCL-1细胞，使用培养液将细胞悬液的密度调整为1×105个·mL-1，以每孔500 μL细胞悬液接种于24孔培养板，按2.2项下方法进行分组和处理。处理结束后，放回培养箱中孵育20 h，收集细胞并用裂解液裂解，提取总蛋白并测定浓度，取适量样本，加Buffer缓冲液并用沸水浴处理，使其变性，经凝胶电泳分离、半干法转膜和脱脂奶粉封闭后，加入按1∶800稀释的一抗(PPIX抗体、ABCG2抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体、Cleaved caspase-3抗体和GAPDH抗体)，4℃孵育过夜，用TBST洗涤3次(10 min·次-1)，加入按1∶3 000稀释的二抗，室温孵育1 h，用TBST洗涤3次，增强化学发光法(enhanced chemiluminescence，ECL)发光显色，凝胶成像仪采集图片，用Image J软件分析灰度值。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值。

3 结果

3.1Ko-143对ALA-PDT诱导TE354.T和SCL-1细胞增殖抑制的影响 与对照组相比，ALA-PDT组和Ko-143组TE354.T、SCL-1细胞增殖抑制率均显著升高(P<0.05)；与ALA-PDT组相比，ALA-PDT+Ko-143组TE354.T、SCL-1细胞增殖抑制率均显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组TE354.T和SCL-1细胞增殖抑制率比较Tab.1 Comparison of proliferation inhibition rates of TE354.T and SCL-1 cells in each group

3.2Ko-143对ALA-PDT诱导TE354.T和SCL-1细胞凋亡的影响 与对照组相比，ALA-PDT组和Ko-143组TE354.T、SCL-1细胞凋亡率均显著升高(P<0.05)；与ALA-PDT组相比，ALA-PDT+Ko-143组TE354.T、SCL-1细胞凋亡率均显著升高(P<0.05)。见图1和表2。

表2 各组TE354.T和SCL-1细胞凋亡率比较Tab.2 Comparison of apoptosis rate of TE354.T and SCL-1 cells in each group

图1 各组TE354.T和SCL-1细胞凋亡情况Fig.1 Apoptosis of TE354.T and SCL-1 cells in each group

3.3Ko-143对ALA-PDT诱导TE354.T和SCL-1细胞氧化应激的影响 与对照组相比，ALA-PDT组和Ko-143组TE354.T、SCL-1细胞中GSH-Px活性均显著降低，MDA含量均显著升高(P<0.05)；与ALA-PDT组相比，ALA-PDT+Ko-143组TE354.T、SCL-1细胞中GSH-Px活性均显著降低，MDA含量均显著升高(P<0.05)。见表3。

表3 各组TE354.T、SCL-1细胞中GSH-Px活性和MDA含量比较 Tab.3 Comparison of GSH-Px activity and MDA content in TE354.T and SCL-1 cells in each group

3.4Ko-143对ALA-PDT诱导TE354.T和SCL-1细胞中ABCG2和PPIX蛋白表达的影响 与对照组相比，ALA-PDT组TE354.T、SCL-1细胞中ABCG2的表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)，PPIX蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)；Ko-143组TE354.T、SCL-1细胞中ABCG2蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)，PPIX蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。与ALA-PDT组相比，ALA-PDT+Ko-143组TE354.T、SCL-1细胞中ABCG2蛋白表达水平均显著降低，PPIX蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。见图2和表4。

图2 各组TE354.T和SCL-1细胞中ABCG2和PPIX的蛋白表达水平

表4 各组TE354.T、SCL-1细胞中ABCG2和PPIX蛋白表达水平比较Tab.4 Comparison of ABCG2 and PPIX protein expression levels in TE354.T and SCL-1 cells in each group

3.5Ko-143对ALA-PDT诱导TE354.T和SCL-1细胞中凋亡相关蛋白表达的影响 与对照组相比，ALA-PDT组、Ko-143组TE354.T、SCL-1细胞中Bcl-2/Bax蛋白的表达水平均显著降低(P<0.05)，Cleaved caspase-3蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05)。与ALA-PDT组相比，ALA-PDT+Ko-143组TE354.T、SCL-1细胞中Bcl-2/Bax蛋白的表达水平均显著降低，Cleaved caspase-3蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05)。见表5和图3。

表5 各组TE354.T、SCL-1细胞中Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达水平比较Tab.5 Comparison of the expression levels of Bcl-2，Bax and cleaved caspase-3 in TE354.T and SCL-1 cells in each group

图3 各组TE354.T和SCL-1细胞中Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3蛋白的表达水平注：A～D分别为TE354.T细胞对照组、ALA-PDT组、Ko-143组和ALA-PDT+Ko-143组；E～H分别为SCL-1细胞对照组、ALA-PDT组、Ko-143组和ALA-PDT+Ko-143组。Fig.3 Expression of Bcl-2，Bax，cleaved caspase-3 in TE354.T and SCL-1 cells in each groupNotes:A-D were control group，ALA-PDT group，Ko-143 group and ALA-PDT+Ko-143 group of TE354.T cell，respectively; E-H were control group，ALA-PDT group，Ko-143 group and ALA-PDT+Ko-143 group of SCL-1 cell，respectively.

4 讨论

皮肤是最大的人体器官，能够保护机体免于发生物理损伤，然而，皮肤在长时间的紫外线或辐射等的照射下，会出现皮肤组织细胞中DNA的断裂，引起皮肤癌变[11]。皮肤基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌是分别由多能性基底样细胞、表皮角质形成细胞异常增生而形成的肿瘤，在恶性皮肤肿瘤中的发病率居前两位，近年来其发病率不断升高[12]。目前治疗皮肤癌的方法有很多，如手术、激光、冷冻、放疗和化疗等，其中手术治疗疗效显著，为首选治疗方案，但其在治疗某些特殊患者时具有很大的局限性，存在创面大、遗留疤痕、不良反应多和美容效果欠佳等缺点[13]。因此，寻找更合适的治疗手段对于皮肤癌的治疗具有重要意义。

ALA-PDT是新兴起的皮肤肿瘤的治疗方式，近年来，由于其具有创伤小、痛苦少、无皮损部位限制等优势，在皮肤浅表肿瘤的治疗中逐渐得到广泛应用。PDT是通过特定波长的激光激活光敏剂，同时与分子氧发生作用，从而产生活性氧分子，通过氧化作用导致细胞膜或蛋白质发生氧化损伤，进而导致细胞死亡[14]。5-ALA是一种血红蛋白合成中间物，在体内的量较少，但某些代谢旺盛的肿瘤细胞可选择性吸收、积累进入体内的外源性5-ALA[15]。5-ALA被肿瘤细胞吸收后代谢为内源性光敏剂PPIX，具有强光敏作用，在特定波长激光的照射下会被激活生成单态氧，进而杀伤细胞，达到治疗肿瘤的目的[13，16]。因此，ALA-PDT对肿瘤细胞的杀伤作用与肿瘤细胞中PPIX的蓄积水平有关。本研究显示，ALA-PDT可以显著提高TE354.T、SCL-1细胞的增殖抑制率及凋亡率，并降低Bcl-2/Bax蛋白的表达水平，提高Cleaved caspase-3蛋白的表达水平，提示ALA-PDT可以下调抑凋亡成员Bcl-2与促凋亡成员Bax的比值，并提高caspase-3活性，抑制皮肤基底细胞癌TE354.T细胞、皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞增殖并诱导其凋亡。GSH-Px是重要的抗氧化酶，可阻止脂质过氧化反应，保护细胞膜的结构和功能，而MDA作为脂质过氧化反应的最终产物，是检测氧化应激反应的重要参考指标[17]。本研究显示，ALA-PDT可以显著提高TE354.T、SCL-1细胞中PPIX蛋白的水平及MDA的含量，降低GSH-Px的活性，提示ALA-PDT会导致TE354.T、SCL-1细胞中PPIX蛋白蓄积，进而提高氧化应激反应，导致TE354.T、SCL-1细胞发生氧化应激损伤并凋亡。

ABCG2是ABC转运蛋白家族成员，在肿瘤中普遍高表达，其会主动将化疗药物泵出细胞外，导致癌细胞耐药[18]。孙伟等[19]研究表明，ABCG2介导恶性脑胶质瘤细胞内PPIX的外流，使用白藜芦醇抑制ABCG2的表达可增加细胞内PPIX的含量，从而提高PDT疗效。Ko-143是一种有效且具有相对选择性的ABCG2抑制剂，是ABCG2特异性抑制剂烟曲霉毒素C(fumitremorgin C，FTC)的衍生物，对ABCG2的抑制作用是FTC的10倍[10]。本研究显示，使用Ko-143辅助ALA-PDT处理TE354.T、SCL-1细胞后，细胞中ABCG2蛋白的表达水平均显著降低，同时PPIX蛋白的表达水平均显著升高，提示Ko-143在显著抑制ABCG2蛋白表达的同时，还能够使PPIX在胞内蓄积。同时，与ALA-PDT组相比，ALA-PDT+Ko-143组TE354.T、SCL-1细胞中GSH-Px的活性及Bcl-2/Bax蛋白的表达水平显著降低，MDA含量及Cleaved caspase-3蛋白的表达水平显著升高，细胞增殖抑制率及凋亡率均显著升高，提示Ko-143抑制ABCG2蛋白表达后，可提高ALA-PDT作用下细胞内PPIX蛋白的蓄积量，导致细胞氧化应激反应加剧，提高ALA-PDT对TE354.T、SCL-1细胞增殖的抑制及对凋亡的促进能力。

综上所述，ABCG2抑制剂Ko-143能抑制ABCG2的表达，提高PPIX蛋白在胞内的蓄积水平，对ALA-PDT诱导TE354.T、SCL-1细胞氧化应激损伤和凋亡具有促进作用，对临床减少ALA-PDT抵抗、提高ALA-PDT疗效可能具有一定价值。