羊口疮病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR法的建立

张敏，杨丹娇，蓝岚，刘怡雯，叶忠明

（四川省甘孜藏族自治州畜牧业科学研究所，四川康定 626000）

羊口疮又称羊传染性脓疱，是由羊口疮病毒（ORFV）引起的一类人兽共患接触性传染病。该病多见于小反刍兽，其中羊群最为易感。羊口疮病毒属于痘病毒科、副痘病毒属，该病毒具有很强的嗜上皮性，感染羊病程初期主要表现为口唇、舌、鼻部出现红疹，进而表现为张口呼吸、口腔分泌物增多、流涎、采食减少，病程后期食欲废绝，感染部位有明显的水泡、脓疱、糜烂，最后形成结痂［1］。该病分布广泛，澳大利亚、新西兰、意大利、印度、韩国等均有羊口疮发病的报道［2］。近年来我国大力发展养羊业，羊只交易频繁，加速了该病在我国各地区的发生。有报道我国甘肃、新疆等省份发生过该病［3］。

注射疫苗是预防该病的有效方法，但是我国至今还没有ORF商品化疫苗，疫苗研究还处于实验室评估阶段［4］。因此，及时准确地诊断该病，并对患病羊进行隔离和对症治疗，是阻止该病扩散的有效途径。目前，用于诊断ORF的方法主要有电子显微镜检查、血清学方法、PCR扩增、LAMP技术等［5］。SYBR Green Ι 实时荧光定量PCR和常规方法相比，具有特异性强、灵敏度高等突出优势［6］。本试验基于临床上快速高通量检测OR⁃FV的需求，建立了快速检测ORFV DNA的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法。

1 材料

1.1 毒株 羊口疮病毒四川毒株（ORFV-SC）由西南民族大学实验室分离鉴定并保存。山羊痘疫苗、绵羊痘疫苗均由西南民族大学实验室保存。

1.2 主要试剂及仪器 质粒提取试剂盒购自OMEGA Bio-Tek公司；SYBR Premix Ex Taq ΙΙ试剂、DL2000 DNA Ladder、胶回收试剂盒、pMD19-T载体、DH5-α感态细胞均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；电泳琼脂糖购自Oxoid公司；岛津紫外可见分光光度计BioSpec-nano购自岛津企业管理（中国）有限公司；荧光定量96孔PCR仪，购自杭州博日科技有限公司。

1.3 引物 参照文献［7-8］合成扩增B2L全长基因的特异性引物；参照GenBank中登录的ORFV B2L全基因（登录号：MK645803.1），运用Primer 7设计荧光特异性引物（表1）。两对特异性引物均由生工生物工程有限公司合成。

表1 引物信息表

2 方法

2.1 羊口疮病毒重组质粒的构建及测序鉴定以ORFV-SC毒株DNA为模板，PCR特异性扩增出B2L全长基因（1 137 bp）。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，切下阳性条带。根据凝胶回收试剂盒说明书回收目的DNA，后将目的片段与pMD19-T载体连接，构建含B2L基因的重组质粒，将连接产物转化DH5-α感受态细胞，划线培养于含氨苄的LB固体培养基上。37℃恒温过夜，盲挑转化生长的菌落进行培养。根据质粒提取试剂盒说明书提取质粒，并以其为模板进行常规PCR鉴定，然后将菌液送检测序。测序结果经DNAStar和BLAST比对，比对正确的作为阳性标准品。

2.2 羊口疮病毒重组质粒浓度和纯度的测定及拷贝数的换算 利用岛津紫外可见分光光度计测定质粒DNA样品液的质量浓度，并换算为质粒拷贝数。计算公式如下：拷贝数（copies/μL）＝OD260×50×稀释倍数×10-9×6.02×1023/（660×碱基数）。

2.3 SYBR Green Ι 实时荧光定量PCR最佳引物浓度的筛选 20 μL体系：SYBR Premix Ex Taq ΙΙ（含SYBR Green Ι）10 μL，以重组阳性质粒标准品为模板，取2 μL模板，10 μmol/L的上下游引物各0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 μL（20 μL反应体系中所对应的终浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 μmol/L），添加ddH2O补足20 μL体系。反应条件：95 ℃预变性2 min；然后95 ℃5 s，60 ℃45 s，共40个循环，以筛选最佳引物浓度。

2.4 标准曲线的建立 分别以不同稀释度拷贝数（2.13×102～2.13×108copies/μL）质粒作为模板，用优化好的反应条件和反应体系进行扩增，以拷贝数对数为横坐标，以Ct值为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线）。

2.5 特异性和灵敏性试验

2.5.1 特异性试验 用建立好的方法对山羊痘病毒、绵羊痘病毒以及羊口疮病毒的核酸进行检测。

2.5.2 灵敏性试验 对重组质粒阳性标准品进行10倍系列（2.13×108～2.13×10-1copies/μL）稀释，将稀释的阳性质粒标准品作为模板，分别进行实时荧光定量PCR和常规PCR检测，比较两者的灵敏性。

2.6 重复性试验 用优化好的反应条件分别对3个稀释度（2.13×104～2.13×106copies/μL）的阳性标准样品进行检测，每个稀释度同时进行3次重复检测。上述阳性标准品于-80 ℃保存，间隔一周进行复检，共检3次，依据Ct值计算变异系数。

2.7 临床样品的检测 从频发羊口疮的某山羊养殖场采集180份血清进行羊口疮病毒检测，用已建立的SYBR Grenn I实时荧光定量PCR和常规PCR分别进行检测，比较阳性检出率。

3 结果

3.1 ORFV B2L全长基因扩增及克隆鉴定结果 采用ORFV B2L特异性引物扩增出了约11 00 bp的PCR产物（图1），与预期结果相符合。pMD19-T载体阳性克隆菌的测序结果经DNAstar和BLAST比对，其目的基因已经克隆到pMD19-T载体，表明成功构建了含B2L基因的重组质粒。

图1 PCR扩增产物

3.2 重组质粒阳性标准品浓度测定及拷贝数换算结果 经测定，重组质粒的质量浓度为91.03 ng/μL，OD260/OD280为1.97。计算得出重组质粒阳性标准品的拷贝数为2.13×1010copies/μL。

3.3 最佳引物浓度筛选结果 采用优化好的循环条件，对引物终浓度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 μmol/L进行优化，结果得出当引物浓度为0.5 μmol/L时能扩增出标准曲线，且有最小的Ct值和最大的荧光值。

3.4 标准曲线 分别以不同稀释度拷贝数（2.13×102～2.13×108copies/μL）质粒作为模板，用优化好的反应条件和反应体系进行扩增，获得扩增曲线（图1），以拷贝数对数为横坐标，以Ct值为纵坐标获得标准曲线（图2）。

3.5 特异性试验 采用建立的ORFV SYBR Green I实时荧光定量PCR方法对山羊痘病毒（GPV）和绵羊痘病毒（SPV）核酸进行特异性检测，结果均未扩增出，而山羊口疮病毒具有良好的扩增曲线（图4），表明所建立的方法特异性强。

3.6 敏感性试验 由图5可知，实时荧光定量PCR和常规PCR的最低检测限分别为2.13×101、2.13×103copies/μL，表明ORFV SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的灵敏度优于常规PCR方法。

图2 ORFV SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增曲线

图3 ORFV SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线

图4 SYBR Green I实时荧光定量PCR特异性试验结果

图5 敏感性试验结果

3.7 重复性试验 将重组质粒进行10倍系列稀释，选取2.13×104、2.13×105、2.13×106copies/μL 3个稀释度进行实时荧光定量PCR扩增，计算得出批内变异系数和批间变异系数分别为0.437%～1.061%、0.554%～1.104%（表1），批内和批间变异系数均小于2.5%，表明该方法的重复性好。

3.8 临床样品检测情况 检测180份山羊血清，常规PCR的阳性检出率为2.8%（5/180）（图6），实时荧光定量PCR的阳性检出率为4.4%（8/180）。常规PCR检出的5份阳性样品，采用实时荧光定量PCR也都能检出。

表1 实时荧光定量PCR的Ct值

图6 常规PCR检测的ORFV临床血液样本

4 结论与分析

羊口疮病毒编码区中间部分为中心保守区，两端为末端变异区，而B2L基因位于羊口疮病毒第11个完整开放阅读框，高度保守［9］。本试验基于B2L基因合成一对特异性引物，用于构建羊口疮SYBR Green I实时荧光定量PCR法，结果表明该方法特异性强、重复性好，无引物二聚体和非特异性扩增。

本试验所建立的实时荧光定量PCR法，在灵敏度检测中的最低检测限可达2.13×101copies/μL，相较于某些文献报道的同一方法高出数倍。出现这样的比对结果，是因为DNA的纯度存在一定差异。本试验建立的羊口疮病毒B2L基因重组质粒，经测定所得纯度高，而从组织病料和细胞中提取的病毒DNA存在细胞DNA和RNA的双重污染，由于目的DNA的纯度不高，使得所建立方法的灵敏度降低。

PCR的检测结果常作为目标基因存在与否的重要依据。引物的特异性是PCR检测是否准确的前提。但是在实际操作中往往发现PCR产物经凝胶电泳，经常出现无条带、无目的条带或多条带的现象，此时很难分辨是否存在引物二聚体或者引物和DNA的错配，而荧光定量PCR可以通过分析熔解曲线，从而确定是否存在引物设计不合理的情况。本研究建立的实时荧光定量PCR方法经熔解曲线分析只出现单一特异性峰，证明设计的引物特异性好。

实时荧光定量PCR依据其自身的优越性已广泛应用于各个领域［10］。对于羊口疮，建立快速的检测方法可及时确定病原，从而为ORF的防控提供依据。本研究构建的ORFV实时荧光定量PCR法，适用于羊口疮的临床检测。■