廿二碳六烯酸联合有氧运动干预对轻度认知功能障碍模型小鼠学习记忆能力的影响及其机制

方 侃，吕光辉，汪新体，艾志兵，王启斌

(湖北医药学院附属太和医院，湖北 十堰 442000)

阿尔茨海默病(AD)是一种以进行性认知功能障碍为主要特征的中枢神经系统退行性疾病，其病理学特征为神经元外β淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成老年斑、神经元内异常磷酸化Tau蛋白聚集形成神经原纤维缠结及大脑皮质、海马胆碱能神经元大量丢失伴胶质细胞增生等[1-2]，通常经历了主观认知功能下降期、轻度认知功能障碍期及痴呆期3个阶段。而轻度认知功能障碍是介于正常认知和痴呆之间的一种认知缺损的过渡状态，具有转化为AD的高度危险性。目前AD疗效差的主要原因是干预时机太晚和措施单一，在明确AD诊断时认知损害已不可逆转[3]。廿二碳六烯酸(DHA)是不饱和脂肪酸家族中最重要的成员，其可通过多种机制来防治AD[4-6]。有研究表明，有氧运动干预可以延缓AD认知功能下降的速度[7-9]。因此，本研究尝试建立具有临床轻度认知功能障碍特征的动物模型，试图从轻度认知功能障碍阶段进行早期干预，探讨DHA联合有氧运动干预对轻度认知功能障碍模型小鼠学习记忆能力的影响及其机制，从而为有效预防AD的发生提供实验数据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级健康雄性昆明小鼠100只，16月龄，体质量50～55 g，由湖北医药学院实验动物中心[SYXK(鄂)2016-0031]提供，生产许可证号：SCXK(鄂)2016-0008。本课题经湖北医药学院附属太和医院伦理委员会审查备案。实验前将小鼠适应性喂养1周，自由饮食，湿度50%～60%，室温(22±2)℃，光照12 h/d。

1.2实验仪器及试剂 MT-200水迷宫行为学跟踪系统(成都泰盟)；SA101小动物跑台(江苏赛昂斯)。D-半乳糖 (美国Amresco公司)；DHA[梯希爱(上海)化成公司]。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)检测试剂盒(武汉博士德公司，比色法)。胆碱乙酰转移酶(ChAT)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、β淀粉样蛋白42(Aβ42)及磷酸化Tau蛋白(P-tau) 酶联免疫吸附试验试剂盒(美国elabscience公司)。改良Bielschowsky神经染色液(武汉卡诺斯公司)。

1.3实验动物分组及模型复制 按数字表法将小鼠随机分为对照组、模型组、有氧运动组、DHA组、联合组，每组20只。模型组、有氧运动组、DHA组、联合组小鼠连续4周腹腔注射D-半乳糖120 mg/(kg·d)和灌胃三氯化铝35 mg/(kg·d)建立轻度认知功能障碍模型，对照组腹腔注射相应剂量的生理盐水和灌胃相应剂量的生理盐水。

1.4干预措施

1.4.1跑台运动干预 对有氧运动组、联合组小鼠实施有氧运动干预。①适应性跑台训练：第1天运动速度为12 m/min，训练时间为20 min；随后4 d运动速度不变，训练时间每天增加10min，直至60 min/d。②正式跑台运动训练：坡度为0°，第1周运动速度设定为15 m/min，以后每周增加3 m/min，直至24 m/min；连续4周，每周训练5 d，每天训练60 min。另3组小鼠在同时间点放在跑台上自由运动相应的时间。

1.4.2DHA干预 对DHA组、联合组小鼠腹腔注射 DHA 360 mg/(kg·d)，连续4周；另3组小鼠同时间点腹腔注射同剂量的生理盐水。

1.5检测指标及方法

1.5.1Morris水迷宫实验 ①定位航行实验：随机从不同象限将小鼠面对池壁轻轻放入水中，记录小鼠找到平台所用的时间，即逃避潜伏期；若小鼠60 s内未找到平台，则将该小鼠放在平台上停留15 s，计其逃避潜伏期为60 s，连续4 d。②空间探索实验：定位航行实验结束后次日，撤除平台，记录小鼠穿越原平台位置的次数和在各象限探索的时间百分比(目标象限/对立象限)。

1.5.2取材及处理 水迷宫实验结束后，断头取脑，迅速分离并取下海马组织。各组20只小鼠的一侧海马组织(左侧或右侧，随机)装入EP管，投入液氮中，用于酶联免疫吸附试验等检测；而另一侧海马组织投入4%多聚甲醛溶液中固定，用于改良Bielschowsky神经染色液染色(简称银染)标本的制作。

1.5.3海马组织氧化应激指标、ChAT、AChE及Aβ42/P-tau测定 从液氮中取出海马组织，平衡温度后称质量，按质量/体积比(1∶9)加入4 ℃生理盐水，用组织匀浆器制作成10%的海马组织匀浆；置于离心机(转速3 000 r/min、半径13.5 cm)中离心15 min，取上清液分装于EP管。按试剂盒说明, 用比色法检测海马组织中SOD、GSH-Px活性及MDA水平；按试剂盒说明，用酶联免疫吸附法(美国热电Multiskan MK3全自动酶标仪)检测海马组织中ChAT、AChE活性和Aβ42、P-tau含量。

1.5.4海马组织改良Bielschowsky神经染色液染色 先制作海马组织石蜡切片，切片厚10 μm；再按照改良Bielschowsky神经染色液使用说明书进行操作,将切片浸染于银溶液中，之后用还原剂处理，使神经元、轴突及神经纤维呈现深棕色或黑色。

2 结 果

2.1各组小鼠Morris水迷宫行为学测试比较 与对照组比较，模型组逃避潜伏期延长,穿越原平台位置次数减少,目标象限空间探索时间百分比降低,对立象限空间探索时间百分比提高，差异均有统计学意义(P均<0.05)；与模型组比较，有氧运动组、DHA组、联合组逃避潜伏期缩短,穿越原平台位置次数增加,空间探索时间百分比目标象限提高而对立象限降低，且联合组变化最明显，DHA组次之，有氧运动组再次之，差异均有统计学意义(P均<0.05)；联合组上述指标与对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠Morris水迷宫行为学测试比较

2.2各组小鼠海马组织中氧化应激指标水平比较与对照组比较，模型组SOD、GSH-Px活性降低，MDA水平升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)；与模型组比较，有氧运动组、DHA组、联合组SOD、GSH-Px活性升高，MDA水平降低，且联合组变化最明显，DHA组次之，有氧运动组再次之，差异均有统计学意义(P均<0.05)；联合组上述指标与对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组小鼠海马组织中氧化应激指标水平比较

2.3各组小鼠海马组织中ChAT、AChE活性和Aβ42、P-tau含量比较 与对照组比较，模型组ChAT活性降低，AChE活性及Aβ42、P-tau含量升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)；与模型组比较，有氧运动组、DHA组、联合组ChAT活性升高，AChE活性及Aβ42、P-tau含量降低，且联合组变化最明显，DHA组次之，有氧运动组再次之，差异均有统计学意义(P均<0.05)；联合组上述指标与对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

2.4各组小鼠海马组织改良Bielschowsky神经染色液染色比较 光镜下观察，对照组海马CA1区锥体细胞排列整齐，细胞内神经原纤维清晰、呈棕黑色、排列规则，可见伸入细胞突起；模型组海马CA1区锥体细胞稍稀疏，核固缩，细胞内神经原纤维肿胀、深染、模糊，细胞外未见Aβ斑或老年斑和神经原纤维缠结；有氧运动组海马CA1区锥体细胞稍增加，核固缩减少，神经原纤维肿胀减轻；DHA组海马CA1区锥体细胞进一步增多，偶见核固缩，神经原纤维肿胀消除；联合组海马CA1区锥体细胞排列有序，细胞内神经原纤维清晰，细胞外未见Aβ斑或老年斑和神经原纤维缠结。见图1。

表3 各组小鼠海马组织中ChAT、AChE活性和Aβ42、P-tau含量比较

图1 各组小鼠海马组织改良Bielschowsky神经染色液染色表现(×400)

3 讨 论

随着我国人口老龄化进程的加剧，AD严重危害着中老年人的身心健康，且已经突显为社会的公共问题。其发病机制不明，尚无有效的治疗药物和治疗技术，目前广大学者更多地将注意力投入到探索轻度认知功能障碍干预途径和机制上，试图从源头上早期防治AD[10]。

关于轻度认知功能障碍动物模型的建立，其应具有以下特征：①老年；②轻度学习记忆损害；③轻度胆碱能神经功能受损；④轻度APP/Aβ代谢紊乱但无老年斑，或轻度Tau蛋白异常磷酸化但无神经原纤维缠结；⑤轻度神经病理学改变。若出现4种及以上特征，即可判断轻度认知功能障碍模型复制成功。目前常采用D-半乳糖和三氯化铝造模，其中D-半乳糖是有机体内的一种还原性糖，老年小鼠腹腔注射后，在醛糖还原酶、半乳糖脱氢酶作用下，小鼠脑内产生大量活性氧自由基，导致氧化应激，引起神经元损伤[11-12]；小鼠灌服三氯化铝，过量的铝激活脑内小胶质细胞，诱发炎性应答，促进活性氧产生，导致神经元凋亡[13]。D-半乳糖和三氯化铝联合作用，共同引起小鼠脑神经损害和神经退行性变，从而出现衰老和学习记忆障碍等表现。本实验结果显示，老年小鼠腹腔注射D-半乳糖和灌服三氯化铝4周后，小鼠出现逃避潜伏期延长,穿越原平台位置次数减少,目标象限空间探索时间百分比降低,对立象限空间探索时间百分比提高，海马组织中ChAT活性降低而AChE活性和Aβ42、P-tau含量升高，海马CA1区锥体细胞稍稀疏、核固缩，细胞内神经原纤维肿胀、深染、模糊，细胞外未见Aβ斑或老年斑和神经原纤维缠结。这些结果符合轻度认知功能障碍动物模型的基本特征，说明模型复制成功。而模型组海马组织中SOD、GSH-Px活性明显降低和MDA水平明显升高，表明小鼠脑内发生了氧化应激。

诸多研究证明，有氧运动干预可以通过促进大脑血管神经再生，改善血液循环和神经连接，提升大脑的整体功能，改善认知功能[14-16]。米志宽等[9]研究提示有氧运动干预可增强衰老大鼠脑组织SOD、GSH-Px活性，降低MDA水平。仝杨杨[17]研究证实有氧运动可明显减少AD小鼠脑内Aβ低聚物的含量。范佳等[8]研究表明有氧运动干预可提高衰老大鼠学习记忆能力。本实验结果显示，有氧运动组干预4周后，小鼠逃避潜伏期缩短,穿越原平台位置次数增加,目标象限空间探索时间百分比提高,对立象限空间探索时间百分比降低，海马组织中SOD、GSH-Px、ChAT活性升高，海马组织中MDA水平、AChE活性及Aβ42、P-tau含量降低，与上述研究结果一致。

DHA为多不饱和脂肪酸，在哺乳动物体内不能合成，被称为必需脂肪酸，其可通过血脑屏障，不仅参与大脑细胞膜的组成，影响细胞膜的流动性与完整性，而且对维持神经元信号转导功能至关重要。赵秀娟等[18]研究结果提示DHA干预可提高老年痴呆大鼠脑组织SOD、GSH-Px活性，降低MDA水平，从而提高大鼠学习记忆能力。王霞等[19]研究报道，DHA可改善D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆能力。本实验结果显示，DHA组小鼠干预4周后逃避潜伏期缩短,穿越原平台位置次数增加,目标象限空间探索时间百分比提高,对立象限空间探索时间百分比降低，海马组织中SOD、GSH-Px、ChAT活性升高，海马组织中MDA水平、AChE活性及Aβ42、P-tau含量降低，与上述研究相吻合。另外，联合组干预4周后上述各指标亦明显改善，且各指标变化均明显优于有氧运动组或DHA组，与对照组接近。表明有氧运动与DHA干预有一定协同性，可以基本逆转轻度认知功能障碍小鼠的病理变化和认知障碍。

综上所述，轻度认知功能障碍的发病因素、发病机制及病理变化比较复杂，大脑神经元丢失和突触减少是一个长期、渐进、缓慢的过程，单一因素的改善，不足以对抗轻度认知功能障碍脑组织退行性变化及认识功能衰退的进程。DHA联合有氧运动干预可以协同通过抑制氧化应激等机制明显提高轻度认知功能障碍模型小鼠的学习记忆能力，为选用具有协同作用的复合方式、多靶点干预轻度认知功能障碍和防治AD提供了参考思路和实验数据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。