正交试验法优选复方舒心康的提取工艺研究*

于 莹，张虎娟，梁 浩，张晓燕，周忠光

（1.黑龙江中医药大学a.中医药研究院；b.研究生院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036）

缺血性心脏病是严重危害人类健康的疾病之一，近年来患病率和死亡率不断上升，尤其是在老年人中呈逐年上升的趋势[1]。本研究中的复方舒心康包括丹参、广枣、檀香、诃子、木棉花等中药，被蒙医用于治疗缺血性心脏病，在多年的使用中效果良好，未见不良反应。丹参为方中君药，丹参酮ⅡA 是中药丹参中的脂溶性成分，现代研究表明，丹参酮ⅡA 具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用[2]。在2020 版《中国药典》中以HPLC 法检测丹参酮ⅡA 的含量为中药材丹参的质量标准参考,因此，本实验以丹参酮ⅡA的含量为复方舒心康的质量控制提供参考。用正交实验设计法，对舒心康的最佳水提提取工艺进行优选。

1 实验部分

1.1 仪器和材料

Dinex Ultiate 3000 型高效液相色谱仪（美国戴安仪器有限公司）；GZX-9070MBE 型电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；SB-5200DT型超声波清洗机（宁波新艺超声波设备有限公司）；RE-52AA 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；XMTD-204 型数显式电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；CPA225D 型电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。

丹参药材（批号1601002 河北全泰药业有限公司）；丹参酮ⅡA 对照品（批号110766-201721 中国食品药品检定研究院）；甲醇（AR 南京化学试剂厂）；乙腈（色谱醇DikmaPure）。

1.2 实验方法

1.2.1 丹参酮ⅡA 的含量测定

1.2.1.1 色谱条件与系统适应性试验[3]采用Diamonsil C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；以乙腈（A）-磷酸水（B）为流动相，按表1 的液相条件进行洗脱；柱温为20℃；检测波长为270nm；理论板数按丹参酮ⅡA 峰计算应不低于60000。

表1 流动相设置条件Tab.1 Setting conditions of mobile phase

1.2.1.2 对照品溶液的制备[4]精密称取丹参酮ⅡA 标准品5.0012mg，用甲醇于5mL 容量瓶中定容，摇匀。精密量取上述对照品溶液1mL，置于50mL 容量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得丹参酮ⅡA 对照品溶液，浓度为20.0048μg·mL-1。

1.2.1.3 供试品溶液的制备 取水提醇沉浓缩液，用水定容于100mL 容量瓶，摇匀，即得。

1.2.1.4 阴性对照溶液的制备 称取缺少丹参的全方药材，按水提醇沉工艺制备不含丹参的样品一份，用水定容于100mL 容量瓶，摇匀，即得。

1.2.1.5 专属性试验[5]将上文中所述的对照品溶液、阴性对照溶液和供试品溶液用微孔滤膜滤过（0.45μm），高效液相色谱仪中分别进样10μL。

1.2.1.6 测定方法 将1.2.1.2 中对照品溶液及1.2.1.3中供试品溶液在高效液相色谱仪中分别进样10μL，测定，即得。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的制备

将对照品溶液用甲醇分别按照2、4、6、8、10 倍稀释，精密吸取10μL 注入高效液相色谱仪，按“1.2.1.1”项 下色谱条件测定。分别以丹参酮ⅡA 的含量和色谱峰面积为横、纵坐标，应用Excel 软件处理数据，绘制标准曲线，得到回归方程为:Y=69.66X+0.2946，（R2=0.9998）。

从图1 可以观察到，在相同的液相条件下，在与丹参酮ⅡA 对照品色谱图相同的保留时间处，供试品的色谱图上也存在色谱峰，该峰与其它组分能达到分离;阴性对照溶液色谱图在相对应的位置上无干扰峰，表明在该液相色谱条件下检测丹参酮ⅡA具有专属性。

图1 丹参酮ⅡA 的标准曲线图Fig.1 Standard curve of tanshinone ⅡA

2.2 精密度试验

取“1.2.1.2”项下对照品溶液，连续进样6 针，每次进样量10μL，记录对照品溶液在检测波长270nm的峰面积，结果显示，丹参酮ⅡA 的峰面积RSD 为1.86%，表明该实验仪器精密度良好。

2.3 稳定性试验

按“1.2.1.2”项下方法制备舒心康提取液，分别于2、4、6、8、10h 进样10μL，按“1.2.1.1”项下色谱条件测定放置不同时间后样品中丹参酮ⅡA 含量变化，计算得RSD 为1.13%，表明样品中丹参酮ⅡA放置10h 以内稳定性良好。

2.4 正交试验设计

以舒心通提取液中丹参酮ⅡA 的含量和干浸膏得率为工艺考察标准，按4 因素3 水平进行L9（34）正交试验设计，选择醇沉浓度（A）、提取次数（B）、加水量（C）和提取时间（D）4 个因素进行考察，见表2。

表2 正交试验提取因素水平表Tab.2 Table of factors and levels of orthogonal test

2.4.1 提取方法 按处方称取9 份全方药材，每份55 g，采用正交设计试验L9（34），选取4 个因素水平（见表2），按照正交试验方案，水煎煮过滤，向滤液中加入75%～85%乙醇溶液，静置析出沉淀后，过滤，将滤液浓缩，用水定容至100mL，制得相应的9 个样品溶液。

2.4.2 收膏率的测定 将上述制得的9 个样品溶液精密量取50mL，分别置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，在80℃下减压干燥至恒重，精密称定药膏的质量，计算收膏率。

2.4.3 评价指标及结果分析[6-9]正交试验结果采用直观分析和方差分析相结合，结果见表3、4。

表4 综合评分方差分析结果Tab.4 Table of factors and levels of orthogonal test

根据直观分析和方差分析结果，综合评分的极差大小显示各因素作用主次为B＞D＞C＞A，即提取次数对丹参酮IIA 含量影响最大，其次为提取时间、加水量、醇沉浓度，最优水提醇沉工艺组合为A3B3C3D2。即用12 倍的水，热回流提取3 次，每次1.5h，用85%乙醇沉淀后，取滤液。

2.4.4 验证性实验 按处方分别称取全方药材3 份，每份55g，按本实验得出的最佳的工艺方案进行3次验证试验，测定样品中丹参酮ⅡA 的含量和干浸膏得率。结果说明，优选的工艺中丹参酮ⅡA 的含量和干浸膏得率的综合评分最高，RSD 为2.21%。结果表明，该优选工艺稳定可行。

通过以上实验结果得出，舒心康提取的最佳工艺为:用12 倍的水，热回流提取3 次，每次1.5h，用85%乙醇沉淀后，取滤液。

3 结论

（1）舒心康中君药为丹参和广枣，丹参酮ⅡA 在《中国药典》中作为检测丹参药材质量的指标，该成分的提取制备工艺较简易，检测方法也具体清晰。广枣中主要成分有没食子酸[10]，但该方中另外一味药材诃子中也含有没食子酸[11]。因此，选用丹参酮ⅡA 和干浸膏得率作为优选舒心康提取工艺的检测指标。

（2）本实验通过正交试验，对药物的提取次数、提取时间、加水量、醇沉浓度4 个因素进行考察，以干膏得率和丹参酮ⅡA 作为指标综合评价，筛选出舒心康的最佳提取工艺，为该药在实际生产中节约时间及提高药物疗效奠定了一定的基础。