RP-HPLC-UV 法测定清心莲子饮基准物质中京尼平苷酸的含量*

那效旗，陈忠新，苟鑫宇，田 明

（黑龙江中医药大学 教育部北药基础与应用研究重点实验室 中药药剂学实验室，黑龙江 哈尔滨 150040）

清心莲子饮是国家中医药管理局公布的第一批经典名方，源于宋代《太平惠民和剂局方》卷五，全方由去心的莲子肉，黄芩，蜜炙黄芪，人参，茯苓，蜜炙甘草，麦冬，地骨皮，车前子九味中药材共同组成[1]。依据古籍中记载的制备方法，结合现代科技，开展煎煮、浓缩、干燥等过程的研究，确定其“基准物质”为冻干粉。全方清泻心火，补气养阴，收敛固下。现代，临床多用于尿路感染等泌尿系统疾病，应用广泛，具有很好的开发价值[2，3]。《医方考》记载：“此方主要用于患劳淋病的人。只有用车前子的滑，才能使得淋去。”据现代研究，车前子中的京尼平苷酸淡渗利湿[4]，在全方中起不可或缺的作用，为更好保证全方的药理药效作用，本文采用RP-HPLC-UV 法建立清心莲子饮基准物质中京尼平苷酸含量的测定方法，客观、高效、量化地反映出清心莲子饮的质量，为下一步清心莲子饮复方制剂的质量控制提供研究和借鉴的方法。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂和药材

AB204-N 型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；BL6-180A 型超声波清洗仪（上海比朗仪器有限公司）；Thermo -Sciencetific Ultimate3000 型高效液相色谱仪（包括UV 检测器，美国Thermo 公司）。

甲醇（色谱纯 迪马科技公司）；纯净水（屈臣氏有限公司）；HAc（AR 天津市富宇精细化工有限公司）。

清心莲子饮基准物质（自制，批号：QX20191011，QX20191012,QX20191013）；京尼平苷酸对照品（批号：110721-201014），中国药品生物制品检定所，使用面积归一化法测定其纯度大于98%。方中车前子等药材均购自河北安国药材市场，均经黑龙江省中医药大学药学院，中药鉴定教研室王振月教授鉴定基原。

1.2 方法与结果

1.2.1 供试品提取溶剂的考察 称取清心莲子饮物质基准（批号：QX20191011）各0.22g，共3 份。分别将其置于具塞锥形瓶中，加入浓度分别为30%、60%、90%和100%的甲醇20mL，密塞。以250W 功率，40kHz 超声20min，取出锥形瓶并摇匀，滤过，续滤液蒸干，残渣加入甲醇溶解，定容至10mL 容量瓶中，即得。将其分别置于液相色谱仪中，各进样10μL，测得峰面积。结果表明，将60%的甲醇作为提取溶媒时，京尼平苷酸含量最高。结果见表1。

表1 供试品提取溶剂结果Tab.1 Result table of extraction solvent of samples

本文分别对提取方法，提取溶剂进行考察，以选出最终优化制备方法。首先考察将汤剂水浴蒸干，干燥后用甲醇复溶，观察色谱基线，灵敏度等，发现分离效果和分离度不如采用清心莲子饮基准物质制备效果好。取清心莲子饮基准物质分别加入浓度为30%、60%、90%、100%的甲醇[5，6]，结果表明，用浓度60%甲醇作为提取溶媒时，京尼平苷酸含量最高。故采用浓度为60%的甲醇作为提取溶媒，提取清心莲子饮基准物质。

1.2.2 供试品的制备 根据上述试验结果，确定本品供试液制备方法如下：取清心莲子饮基准物质0.22g，精密称定，置于50mL 具塞锥形瓶中，加入浓度为60%的甲醇20mL，密塞。以功率为250W、频率为40kHz 超声20min，取出，摇匀，滤过，续滤液蒸干，用浓度为60%的甲醇定容至10mL 容量瓶中，即得。

1.2.3 对照品的制备 取一定量的京尼平苷酸对照品，精密称定。加甲醇定容至10mL 容量瓶中，制成浓度为0.09mg·mL-1的溶液，即得。

1.2.4 阴性对照溶液的制备 按清心莲子饮物质基准制备工艺，称取除车前子外的其他8 味药材饮片（共计13g），制成缺车前子的阴性冻干粉，按1.2.2项下制成车前子阴性样品对照溶液。

1.2.5 色谱条件 采用色谱柱：依利特 C18柱（Sinochrom ODS-BP,4.6mm×200mm,5μm）；柱温箱调为25℃；流动相流速为1.0mL·min-1；检测波长为254nm；样品进样量为10μL；流动相A：甲醇，流动相B：0.5% HAc 溶液；按照时间梯度洗脱程序进行梯度洗脱，洗脱条件：0～1min，5% A；1～14min，5%～32% A；供试品及对照品中各色谱峰均呈现较好的分离效果，相应色谱峰的理论塔板数均大于3000，色谱图见图1。

图1 色谱图Fig.1 Chromatograms

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1 线性关系考察 精密吸取0.09mg·mL-1的京尼平苷酸对照品溶液，设置高效液相色谱仪自动进样器的进样量分别为2、4、6、8、10μL，按“1.2.5”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。横坐标（X）为进样质量（μg），纵坐标（Y）为峰面积。进行线性回归后得到线性回归方程：Y=11.185X+0.065（R2=0.9999），线性范围：0.18～0.90μg。结果表明，在线性范围内，峰面积积分数值与其呈现的线性关系良好，标准曲线见图2。

图2 京尼平苷酸标准曲线Fig.2 Standard curve of geniposidic acid

2.1.2 仪器精密度试验 精密称定清心莲子饮物质基准（批号：QX20191011）0.22g，按1.2.2 项下确定的方法制备供试品溶液，每次进样10μL，连续进样6次，记录峰面积，以京尼平苷酸为测定指标，RSD 值为0.76%（RSD＜3%），表明仪器精密度良好。

2.1.3 重复性实验 精密称取同一批清心莲子饮物质基准6 份，按照1.2.2 项下的方法分别制成基准物质的供试品溶液，各进样10μL，计算含量与RSD 值。结果见表2。

表2 京尼平苷酸重复性试验结果Tab.2 Result of geniposidic acid repeatability test

由表2 可见，京尼平苷酸的平均含量（n=6）为4.8025mg·剂-1，RSD（n=6）为2.65%（RSD＜5%），结果表明，该方法重复性良好。

2.1.4 稳定性试验 取清心莲子饮物质基准（批号：QX20191011）0.22g，精密称定，按1.2.2 项下确定的处理方法，制备供试品溶液。将其置于液相色谱仪中，设置程序每隔1h 进样10μL，连续进样12h。结果见表3。

由表3 可见，在12h 内供试品溶液中京尼平苷酸含量稳定，RSD 值小于3%。说明供试品溶液在配制完成后的12h 内测定均稳定。

表3 京尼平苷酸稳定性试验结果Tab.3 Stability test result of geniposidic acid

2.1.5 加样回收率试验 取一定量已知含量的清心莲子饮物质基准冻干粉6 份，分别精密称定，再在每份样品中分别加入0.14mg·mL-1的京尼平苷酸对照品溶液1mL，按1.2.2 项下确定的方法制备供试品溶液，每次进样10μL，计算加样回收率，结果见表4。

表4 京尼平苷酸加样回收试验结果（n=6）Tab.4 Test result of recovery of geniposidic acid by adding samples（n=6）

由表4 可知，结果均在95%～105%之间，说明该方法测定的京尼平苷酸含量符合要求。该方法学合理，可靠。

2.2 含量测定

取不同批次的清心莲子饮基准物质3 批，按照2.2 项下制备供试液，按照1.2.5 色谱条件进样，将得到的色谱峰面积代入到线性回归方程中，计算清心莲子饮基准物质中京尼平苷酸的含量，结果见表5。

表5 京尼平苷酸含量测定（mg·剂-1,n=3）Tab.5 Determination of geniposidic acid content（mg·dose-1,n=3）

由于饮片产地不同，批次不同，导致制备的清心莲子饮物质基准含量有所差异，为确定各批次清心莲子饮物质基准含量在合理波动范围内，取3 批清心莲子饮物质基准测定，京尼平苷酸的含量为4.57～4.88mg·剂-1，平均值为4.76mg·剂-1。

3 结论

本文采用RP-HPLC-UV 法建立了对清心莲子饮基准物质中京尼平苷酸含量的测定方法，该方法具有较好的专属性，准确性和灵敏度，操作简单，重复性好，分离度良好，精密度、稳定性、加样回收率符合方法学验证要求，该方法可作为对清心莲子饮基准物质中京尼平苷酸含量测定的方法，亦可为清心莲子饮的质量控制提供实验依据和方法。