地黄饮超声提取工艺的研究*

扈本荃，徐 玥，吴 曼，王 娜

（西安医学院 药学院，陕西 西安 710021）

地黄饮出自宋代刘河间的《素问·宣明论方》，主要由熟地、巴戟天、山茱萸、肉苁蓉等10 余味药材组方，此方在临床主要以汤剂口服，用来治疗脑中风后遗症和阿尔茨海默症，改善、提高患者的认识功能、学习能力和记忆力[1,2]。

地黄饮汤剂传统工艺为煎煮法,以水为提取剂，应用于临床时，吸收快、起效快。但因分次煎煮合并提取液使用，未浓缩，使用剂量大。

苯乙醇苷类（Phenylethanoid glycoside)天然提取成分松果菊苷(Echinacoside)是君药肉苁蓉的有效成分，研究表明，其具有改善学习记忆、保护神经等方面作用，但是，在超过60℃时会被破坏[3]。传统煎煮工艺会破坏地黄饮中的Echinacoside，若能寻找一种既能保护松果菊苷又能保证提取效率的新的提取方法，将会提高地黄饮在临床上的治疗效果，对老年患者的学习记忆能力和认识功能将有明显的改善和提高。

本文采用正交实验设计，考察乙醇浓度、物料溶液比、提取时间和提取温度对地黄饮超声提取的影响。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

KQ5200DE 型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；DINOEX P680A 型高效液相色谱仪（变色龙色谱工作站，戴安公司）；SHHW21.420 型电热恒温水浴箱（北京市永光明医疗仪器厂）；GR-202 型分析天平（日本A＆D 公司）；101-0 型电热鼓风恒温干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；GG17 型旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）。

马钱苷对照品（Loganin，含量99.2%，中国药品生物制品检定研究院）；Echinacoside对照品（含量92.5%，中国药品生物制品检定研究院）；毛蕊花糖苷对照品（Verbascoside，含量94.4%，中国药品生物制品检定研究院）；甲醇（色谱纯 科密欧试剂有限公司）；其余试剂为分析纯；水为纯化水。

地黄饮配方药材从达仁堂药店购买，均符合中国药典标准。

1.2 正交因素和水平的选择

1.2.1 乙醇浓度 根据文献[4]报道，在一定条件下，以乙醇为提取剂时，苷类的提取量随着其中含水量的增加而增加，含水多的乙醇中苷类提取量较大。但乙醇浓度低于50% 时，乙醇提取溶剂中含水量的增加并不增加苷类提取量，但却使提取液粘度增加、色素干扰增大，增加了提取液应用前的后处理的繁琐度。综上所述，选择90%、70%、50%乙醇作为正交试验考察的因素和水平。

1.2.2 物料溶液比 物料溶液比不同，提取效果不同。物料溶液比太小，降低超声提取的效果；物料溶液比太大，造成溶剂浪费，而且后期提取液的浓缩处理难度增加。经综合分析，选定物料溶液比1∶8、1∶10、1∶12 作为正交实验因素水平。

1.2.3 提取时间 超声提取具有时间短、效率高的特点。超声波能够通过空化效应、机械效应、热效应等[5]使中药材的细胞壁、细胞膜破碎，溶剂渗透到药材的胞内速度增加，或加速胞内的化学成分扩散到胞外，从而提高提取效率。结合实验具体情况，以提取时间为20、40、60min 作为正交试验的考察因素和水平。

1.2.4 提取温度 据文献[6]报道，提取的温度是影响提取的关键因素之一。温度过低，会影响有效成分在提取溶剂中的溶出；温度过高，有些热敏成分会被破坏，且溶剂挥发严重。综合考虑，选定25、40、55℃作为正交试验考察的因素和水平。

1.3 正交实验

1.3.1 正交实验因素水平表设计 以提取地黄饮的乙醇浓度（A），物料溶液比（B），提取时间（C），超声温度（D）为因素，每个因素3 个水平，选用L9（34）正交表设计正交试验，结果见表1。

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Levels of the factors in orthogonal tests

1.3.2 样品处理 精密称取1/10 量的地黄饮子配方药材粉末，按正交设计（表1）的乙醇浓度及物料溶液比加入提取溶剂，即乙醇，再按正交设计的提取时间和温度进行超声提取，去渣，提取液经真空抽滤，滤液于40℃水浴旋转蒸发浓缩至无蒸发液留出，真空干燥箱干燥、称重，计算干固物得率，再将其溶解于80%甲醇中检测马钱苷、松果菊苷及毛蕊花糖苷含量。按同样的过程重复两次，验证最佳方案。

1.3.3 考察指标的确定 本方以乙醇为溶剂，君药熟地黄和巴戟的有效成分在乙醇中的溶解性不如君药山茱萸和肉苁蓉的有效成分，山萸肉滋补肾阴，肉苁蓉温补肾阳，一阴一阳，故以其为代表，采用山茱萸中的马钱苷、肉苁蓉中的松果菊苷和毛蕊花糖苷为考察指标，同时结合干固物质量综合优选最佳工艺。

1.3.4 马钱苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量的测定[7]

色谱条件 色谱柱为Kromasill C18柱（150mm×4.6mm，5μm)；流动相:甲醇-0.01% H3PO4溶液，0～50min 梯度洗脱；流速:1mL·min-1；柱温：室温；进样量：20μL。在240 和334nm 处双波长检测。

样品含量的测定 分别取正交试验制得的干固物，用适量80%甲醇溶解得供试品储备液。精密量取上述供试品储备液用80%甲醇稀释，依法制得供试品溶液，进样测定，计算含量。

2 结果与讨论

2.1 正交试验结果与分析

将地黄饮干固物重量及松果菊苷、毛蕊花糖苷和马钱苷的含量填入正交表，按照正交试验的要求进行处理，所得实验结果见表2。

经直观分析，地黄饮的最佳提取工艺是A1B3C3D3，即50%乙醇，物料溶液比为1∶12，提取时间60min，提取温度55℃。由正交实验结果中的R 值可以得出，乙醇浓度对提取效果有较显著的影响，物料溶液比、提取时间和提取温度等因素的影响均不显著。影响地黄饮提取率因素的顺序依次为：乙醇浓度、提取温度、物料溶液比、提取时间，该工艺各参数影响因素最大的是乙醇浓度，最小的是超声提取时间见表2。

表2 正交试验结果Tab.2 Results of the orthogonal tests

分析其原因，地黄饮在中等浓度的乙醇中溶解度较大，且其中的有效成分含量也较大。传统提取方法通过升高温度增加被提取成分的溶解度，同时提高其传质速度，而超声提取主要通过细胞破碎作用促进被提取成分向液相传递，而非常规的传质作用，因此，温度的影响在超声提取中不显著，适当增加温度有利于提高成分在溶剂中的溶解度，但超过60℃可增加溶剂挥发而使溶剂浓度减小，且温度过高还会破坏有效成分[8-10]。在参考文献[6]中提到，肉苁蓉在40～60℃范围内，随着反应温度的升高，松果菊苷的含量也随之增加，但温度超过60℃之后，温度升高，提取液中松果菊苷含量降低。因此，在提取过程中，要严格注意温度的变化，避免有效成分被破坏。实验结果表明，提取时间的影响无显著性差异，再次证明了因超声提取效率高，短时间内即可实现较完全的提取。物料溶液比对提取效果的影响差异不明显，证明了超声提取的耗能少，后续处理方便。

2.2 工艺验证实验

按照筛选的最佳工进行了3 批验证实验。以最佳工艺参数进行提取，正交试验所得结论符合实际提取结果。地黄饮中各主要成分的含量均较高（见表3）。

表3 工艺验证试验（%）Tab.3 Results of the verification tests（%）

3 结论

本实验以乙醇为提取剂，通过正交试验对地黄饮的超声提取工艺进行了优选。在确定了超声提取因素的条件下，以地黄饮干固物及马钱苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量为指标，得到其最佳超声提取工艺，即50%乙醇为提取剂，物料溶液比为1∶12，提取时间为60min，提取温度为55℃。

地黄饮传统的煎煮提取方法存在耗时、耗能、提取率低等问题。目前，关于地黄饮的药理实验研究较多，而对其提取工艺的研究较少，本实验的研究结果可为今后地黄饮的提取方法和工艺的改进提供理论参考。通过正交实验，减少了提取时间，提高了提取效率，该工艺可重复，方便，便于实验室及工业生产上的推广应用。