荞麦壳中总黄酮含量测定方法优选*

苏学军，裘 可，宗春燕

（泰州职业技术学院，江苏 泰州 225300）

荞麦是一种一年生双子叶植物，可药食两用。作为消费者喜爱的一种小宗杂粮，荞麦具有独特的营养优势，不仅营养素全面、矿物元素含量丰富，还含有其它禾谷类粮食较为缺乏的赖氨酸和黄酮类物质[1]，常被人们视为“养颜益寿食物、天然保健珍品”。荞麦壳是制作荞麦仁时产生的副产品，目前，荞麦壳除部分用于制作枕芯或饲料外，其余大多作为废弃物而被抛弃[2]。近年来的研究表明，荞麦壳中含有多种活性组分，尤其以黄酮类活性物质居多[2]。荞麦黄酮抗氧化能力强[3]，长期食用可以降血糖、降血脂，调节肠道菌群平衡，甚至有一定防癌抗癌功效[4-6]。从荞麦壳中提取出的黄酮类物质，特别是芦丁，临床上可用于消炎、利尿、解痉、治疗血管病、肥胖症等症状[7]，而使其深受人们的关注。

目前，对于荞麦壳中黄酮含量的测定方法主要采用高效液相色谱法（HPLC）和分光光度法（UV）[8]。HPLC 法虽能同时测定样品中的多种黄酮类组分，但获得的是各黄酮单体的含量，在无法得知样品中所有黄酮类组分的情况下，难以完成总黄酮含量的测定。由于荞麦壳中的黄酮类物质种类较多[9]，因而测定总黄酮含量时选择分光光度法为宜。本文以芦丁为对照品，考察了直接测定法、AlCl3-NaAc 比色法及NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法对荞麦壳总黄酮含量测定的可行性，筛选出一种适宜的测定方法，以期为荞麦壳中总黄酮的提取开发利用提供参考。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

荞麦壳（新街粮油加工厂提供（系泰兴甜荞））；芦丁标准品（上海伊卡生物技术有限公司）；无水乙醇、NaNO2、AlCl3、Al（NO3）3、NaOH、NaAc，均为国产分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

1.2 仪器与设备

UV-1801 型紫外-可见分光光度计（北京北分瑞利仪器有限责任公司）；KQ5200E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DHG-9140A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；BJ-150 型多功能粉碎机（德清拜杰电器有限公司）；80-2 型台式离心机（上海浦东物理光学仪器厂）。

1.3 实验方法

1.3.1 荞麦壳中总黄酮的提取 取适量荞麦壳置减压烘箱中低温烘干水分，直至恒重，取出后立刻粉碎过筛。准确称取3g 荞麦壳粉末，放入250mL 三口烧瓶中，并加入质量分数为70%的乙醇溶液，设定料液比为1∶20（g·mL-1），室温下浸泡1h，然后置于70℃的水浴中回流提取1h。提取液经离心分离后，收集至棕色容量瓶中，冷藏备用。

1.3.2 对照品溶液的配制 精密称取芦丁标准品19.8mg，加入质量分数为70%的乙醇溶液，室温下置超声波清洗器中超声一段时间，待全部溶解后，转入100mL 的棕色容量瓶中，再以上述乙醇定容至刻度，摇匀，配成浓度为198μg·mL-1的芦丁对照品溶液，避光保存备用。

1.3.3 荞麦壳中的总黄酮含量测定方法

直接测定法 取2 只25mL 的洁净的容量瓶，分别移入1mL 荞麦壳提取液、1mL 芦丁对照品溶液，再分别以质量分数为30%的乙醇溶液定容，摇匀后，静置15min，以试剂为空白，在200～600nm 区间进行光谱扫描。

AlCl3-NaAc 比色法 取2 只25mL 的洁净的容量瓶，分别移入1mL 荞麦壳提取液、1mL 芦丁对照品溶液，再分别加入1.5%的AlCl3溶液4mL，1mol·L-1NaAc 溶液8mL，以质量分数为30%的乙醇溶液定容，摇匀后置于30℃水浴中显色反应15min，以试剂为空白，在300～600nm 区间进行光谱扫描。

NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法 取2 只25mL的洁净的容量瓶，分别移入1mL 荞麦壳提取液、1mL芦丁对照品溶液，然后再分别依次移入5%的NaNO2试剂1mL，摇匀静置6min，移入10%的Al（NO3）3试剂1mL，再摇匀静置6min，最后加入10mL 4%的NaOH 溶液，以质量分数为30%的乙醇溶液定容，摇匀后，静置15min，以试剂为空白，在400～600nm 区间进行光谱扫描。

2 结果与讨论

2.1 荞麦壳中总黄酮测定方法优选

芦丁及荞麦壳样品的吸收光谱曲线见图1。

图1 直接测定法吸收光谱曲线Fig.1 Absorption spectrum curve of direct determination method

由图1 可知，两种物质在紫外区的吸收带各不相同，芦丁在紫外区存在两个吸收峰，分别位于257.5 和362nm 处，而荞麦壳样品仅有一个吸收峰在275nm 处。由于紫外区的测定易受溶剂及杂质的干扰[10]，且样品与芦丁的吸收峰相距较远，故不宜选用直接测定法测定。

图2 为AlCl3-NaAc 比色法的吸收光谱曲线。

图2 AlCl3-NaAc 比色法吸收光谱曲线Fig.2 Absorption spectrum curve of AlCl3-NaAc colorimetric method

在芦丁对照品溶液中加入AlCl3显色剂后，芦丁的最大吸收峰红移至416nm 处，而荞麦壳提取液的最大吸收波长在可见光区为404nm。故该法以芦丁为对照品时，可选择416nm 作为测定波长。由于提取液在416nm 处存在本底吸收，因此，后续测定样品中总黄酮含量时，以试液空白为参比，测定吸光度值。

图3 是NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法的吸收光谱曲线。

图3 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法吸收光谱曲线Fig.3 Absorption spectrum curve of NaNO2-Al（NO3）3-NaOH colorimetric method

该法待显色反应发生后，溶液中会出现较多絮状物，离心过滤后测定吸收曲线。荞麦壳提取液的最大吸收波长位于491nm 处，而芦丁在505nm 处有一明显的吸收峰，因此，可选择505nm 作为测定波长。

2.2 标准曲线

移取浓度为198μg·mL-1的芦丁对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，按1.3.3 中AlCl3-NaAc 比色法与NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法进行显色反应，在各法最大吸收波长下测定相应吸光度。以吸光度A 为纵坐标，浓度C（μg·mL-1）为横坐标，得到前者线性方程为A=0.0270C+0.0570，R=0.9999；后者线性方程为A=0.0104C-0.0031，R=0.9998。

2.3 荞麦壳中总黄酮含量测定比较

采用AlCl3-NaAc 比色法和NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法测定荞麦壳中的总黄酮含量，实验结果见表1。

表1 2 种比色法测定荞麦壳中的总黄酮（mg·g-1）Tab.1 Determination of total flavonoids in buckwheat hull by two colorimetric methods

由表1 可以看出，后法的测定值明显高于前法。这是由于荞麦壳提取液中的儿茶素、咖啡酸等酚酸类物质在碱性条件下可与Al（NO3）3发生显色反应，造成测定值偏大。因此，测定荞麦壳中的总黄酮，采用AlCl3比色法专属性强，准确度高。

2.4 方法学考察

2.4.1 稳定性 精密移取1mL 荞麦壳提取液，按1.3.3 中AlCl3-NaAc 比色法进行显色反应后，在静置10、20、30、40、50、60min 时，于416nm 处测定吸光度值，分别为0.3354、0.3401、0.3397、0.3444、0.3500、0.3456，平均吸光度为0.3425，RSD 为1.20%。表明荞麦壳提取液采用AlCl3-NaAc 比色法显色后，吸光度在10～60min 内有较好的稳定性。

2.4.2 精密度 精密移取1mL 荞麦壳提取液，采用AlCl3-NaAc 比色法进行显色反应，于416nm 处连续测定6 次吸光度值，分别为：0.3389、0.3391、0.3404、0.3395、0.3400、0.3398，计算RSD 为0.12%，说明方法的精密度良好。

2.4.3 重现性 按1.3.1 制备荞麦壳提取液，平行移取6 份样品，均为1mL，采用AlCl3-NaAc 比色法进行显色反应，每份样品测定3 次，计算荞麦壳总黄酮含量分 别 为5.324、5.246、5.339、5.424、5.377、5.274mg·g-1，RSD 为0.92%，表明方法的重现性较好。

2.4.4 加标回收率 精密移取1mL 荞麦壳提取液5份，再分别加入芦丁标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，采用AlCl3-NaAc 比色法进行显色反应后，测定吸光度并考察方法的回收率，结果见表2。

表2 加标回收率试验Tab.2 Standard addition recovery test

由表2 可知，该法的加标回收率在97.47%～103.53%之间，RSD 为1.92%，显示结果较为可靠。

3 结论

本实验利用紫外可见分光光度法测定荞麦壳中的总黄酮，通过比较3 种比色法的光谱吸收曲线，并通过方法学验证，确定以芦丁为对照品，采用AlCl3-NaAc 比色法于最大吸收波长416nm 处测定黄酮含量。结果显示，该方法操作简便，稳定性好，专一性强，加标回收率为97.47%～103.53%，可作为荞麦壳中总黄酮的定量分析方法。