补肾化痰方对肾虚模型裸鼠乳腺癌骨转移的影响

王俊涛，李伟明，王祥麒

河南中医药大学，河南 郑州 450046

目前，乳腺癌已成为我国女性发病率和致死率第一位的恶性肿瘤，约70%的乳腺癌患者发生骨转移［1－2］。骨转移易引起重度疼痛、病理性骨折、脊髓压迫及高钙血症等骨相关事件，严重影响患者的生活质量。一旦出现骨转移，疾病即进入不可逆阶段，5年生存率仅有20%［3］。王祥麒教授基于“种子－土壤”学说、“肾主骨生髓”理论，结合骨痛缠绵难愈的症状特点，以补肾填精壮骨、化痰散结止痛为基本原则，使肾气旺、精血足、骨髓生化有源、骨骼得以荣养，从根本上阻断乳腺癌患者发生骨转移。本文观察了补肾化痰方对肾虚模型裸鼠乳腺癌骨转移的影响，现将结果报道如下。

1 材料

1.1 动物30只7～8周龄，体质量20～24 g，雌性裸鼠，在SPF级条件下饲养，由河南省实验动物中心提供，许可证号：SCXK（豫）2010－0002，合格证号：1000142。

1.2 药品与试剂补肾化痰方药物组成：熟地黄30 g，杜仲15 g，怀牛膝15 g，白芥子15 g，生牡蛎30 g，白芍40 g，姜黄15 g，苏木30 g，当归15 g，川芎15 g，均购自河南中医药大学第三附属医院。荧光标记的人乳腺癌骨高转移细胞株（上海中科院细胞库，批号：MDA－MB－231BO）；醋酸氢化可的松注射液 （北京紫竹药业有限公司，批号：C1420227188）；注射用硫喷妥钠（上海新亚药业有限公司，批号：P20170507130032644）；盐酸氯胺酮注射液（西安汉丰药业有限责任公司，批号：C20170724325）；甲状旁腺激素相关蛋白（recombinant parathyroid hormone related protein，PTHrP），Abcam公司，货号：ab239527；转化生长因子β（recombinant transforming growth factor beta，TGF－β），Abcam公司，货号：ab215715；骨唾液酸蛋白（bonesialoprotein，BSP），Abcam公司，货号：ab187051。

1.3 仪器动物化学发光活体成像系统（PerkinElmer公司，型号：IVIS®Spectrum BL）；显微镜（日本奥林巴斯，型号：IX70）；CO2恒温培养箱（Thermo公司）；超净工作台（苏州宏瑞净化科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模及分组30只雌性裸鼠随机分为对照组、模型组及治疗组，每组10只。模型组及治疗组裸鼠用醋酸氢化可的松注射液（38 mg·kg－1）皮下注射，每天1次，连用8 d，制成肾虚模型［3］。

模型制成3 d后，将两组裸鼠腹腔注射硫喷妥钠（37.5 mg·kg－1）和腿部肌肉注射氯胺酮（75 mg·kg－1），麻醉后使用注射器将8×105个人乳腺癌细胞株MDA－MB－231BO单细胞悬液注射入裸鼠左心室，制作骨转移模型［4］。

2.2 给药方法于心室注射细胞株48 h后，治疗组以补肾化痰方灌胃。将生药用5倍体积量水浸泡2 h，煮沸30 min，过滤分离药液及药渣，药渣再加入3倍体积量水煎煮20 min，过滤后留药液，合并两次药液于70℃水浴中浓缩至30 mL。治疗组裸鼠的灌胃剂量为3.67 g·kg－1，其余两组灌胃等量生理盐水，连续2周。

2.3 检测指标与方法

2.3.1 裸鼠体质量的检测 造模当天称裸鼠体质量，造模后每周称1次体质量。

2.3.2 活体显像 裸鼠用异氟烷和高压氧气的混合气体麻醉，然后放入活体显像仪中，摆成仰卧位，四肢伸展，固定好后进行检测。发射波长520 nm，激发波长480 nm，曝光时间为1 s。图像处理软件为IVIS自带的LivingImage活体图像分析系统。记录裸鼠骨转移部位数，骨转移部位总数为该组所有裸鼠骨转移部位数之和。

平均骨转移数＝（该组所有裸鼠骨转移部位数之和／10）×100%

2.3.3 免疫组织化学检测 完成活体成像后脱颈处死裸鼠，在无菌条件下取骨转移灶，称瘤质量，各组织以4%甲醛溶液保存，固定144 h，编号，脱钙15 d。将病变的骨组织标本切成横截面（约为2～3 mm），梯度酒精脱水1次，二甲苯透明，石蜡包埋。切成5μm厚的薄片，温水平展，平铺于载玻片，滤纸吸走多余水分，置于45℃的烤箱烤片24 h。按试剂盒要求对PTHrP、TGF－β、BSP进行免疫组化染色，步骤如下：①脱蜡、水化组织切片；②将组织切片进行抗原修复；③用3%双氧水阻断内源性过氧化物酶离子水，室温（28℃）15 min；④PBS冲洗3次，每次3 min；⑤滴加一抗，4℃过夜。PBS冲洗3次，每次3 min；⑥分别滴加抗体，37℃孵育20 min，PBS冲洗3次，每次3 min；⑦DAB溶液显色，洗脱，转染，脱水固定；⑧使用IPP（Image Pro Plus）医学图像分析软件进行免疫组化定量分析，测定棕黄色部位的总面积大小和总吸光度值，两者之间的比值是表达部位的平均光密度值。

2.4 统计学方法用Excel建立数据库，采用SPSS 22.0统计分析软件对有关数据进行分析。计量资料所有数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较先确定样本是否符合正态分布，再进行方差齐性检验，方差齐性，则采用单因素方差分析；方差不齐，先校正方差，再进行方差分析。检验标准取α＝0.05。

3 结果

3.1 各组裸鼠体质量、瘤质量、骨转移部位数比较与造模前比较，对照组造模后体质量显著增加（P＜0.01），模型组造模后体质量明显降低（P＜0.05），治疗组体质量无明显变化（P＞0.05）；与模型组比较，治疗组造模后体质量明显升高（P＜0.05）。与对照组比较，模型组瘤质量显著增加，骨转移部位数显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，治疗组瘤质量明显减轻，骨转移部位数明显减少（P＜0.05）。见表1。

3.2 各组大鼠骨组织中PTHrP、TGF－β、BSP的表达与对照组比较，模型组大鼠骨组织中PTHrP、TGF－β、BSP表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，治疗组PTHrP、TGF－β、BSP表达明显降低（P＜0.5）。见图1、图2、图3，表2。

表1 各组裸鼠体质量、瘤质量、骨转移部位数比较 （±s，g）

表1 各组裸鼠体质量、瘤质量、骨转移部位数比较 （±s，g）

注：与造模前比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

组别 n 造模前体质量 造模后体质量 瘤质量 骨转移部位数／个对照组 10 21.58±0.35 22.38±0.29** 2.14±0.35＃＃ 4.00±1.05＃＃模型组 10 21.41±0.28 20.83±0.74* 3.06±0.48 6.10±0.74治疗组 10 21.49±0.52 21.41±0.44＃ 2.61±0.42＃ 5.10±0.88＃

图1 各组大鼠骨组织中PTH rP表达情况

图2 各组大鼠骨组织中TGF－β表达情况

图3 各组大鼠骨组织中BSP表达情况

表2 各组大鼠骨组织中PTH rP、TGF－β、BSP的表达 （±s）

表2 各组大鼠骨组织中PTH rP、TGF－β、BSP的表达 （±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05

BSP对照组组别 n PTHrP TGF－β 10 24.82±7.50 27.72±12.73 23.17±8.39模型组 10 78.84±6.44* 74.41±12.91* 76.35±9.42*治疗组 10 66.37±8.12＃ 53.92±11.56＃ 64.28±7.94＃

4 讨论

乳腺癌骨转移患者疼痛剧烈，严重影响患者生活质量，许多学者均进行了相关研究［5－9］。有学者认为，肿瘤相关巨噬细胞为骨转移的重要参与者［10］，而何玉峰等［11］则提出人体ER、PR、HER－2表达与乳腺癌骨转移具临床相关性。从骨转移学说分析，PTHrP由肿瘤细胞分泌，为破骨细胞活性介导因子之一，刺激骨细胞或基质细胞RANKL合成增加，诱导破骨细胞前体分化成熟而具骨吸收活性［12－13］。TGF－β主要由成骨细胞、破骨细胞以及软骨细胞合成，其C端存在RGD序列与成骨细胞和破骨细胞表面的整合素avβ3识别而导致肿瘤细胞与骨小梁的黏附，促进骨转移进程。此外，BSP可参与信号的识别［14－15］，细胞黏附与转移且其可通过自分泌方式促进破骨细胞分化，促成乳腺癌的溶骨性转移。

中医学认为，乳腺癌发病高峰为“女子七七”之时，此时肾精衰竭，加之癌症日久，复经手术、放疗、化疗等，肾精耗伤，无以充髓养骨，以致毒邪趁虚而入，凝结于骨而成骨转移。中医药治疗乳腺癌骨转移当攻补兼施，补肾壮骨治其本，化痰散结治其标［16－17］。补肾化痰方中熟地黄有益精填髓、滋阴补血之功，为“滋真阴、填骨髓之圣药”；杜仲具有补肝肾、强筋骨的功效，能改善乳腺癌骨转移患者肾功能［18］，二者共为君药。怀牛膝可引血下行、引药入肾，具有通利肢节筋脉之效；白芥子有走散宣通、利气散结、通行经络之功，以缓解疼痛；生牡蛎出自《医学心悟》之消瘰丸，功用清热消痰，软坚散结；白芍，泄气行血，酸甘化阴，制诸药苦辛燥烈之性，且缓骨转移之痛，四者共为臣药。当归补血活血、祛瘀止痛；川芎活血行气止痛；姜黄破血行气、通经止痛；苏木行血破瘀、消肿止痛，共为佐药。上述药物合用，共同发挥补肾化痰、散结止痛之效［19－20］。

本研究说明，肾虚能导致乳腺癌骨转移加重，而益肾化痰方能降低肾虚所导致的乳腺癌骨转移的程度；乳腺癌骨转移的发生、发展过程中可能有PTHrP、TGF－β、BSP的表达异常，益肾化痰方减轻乳腺癌骨转移的机制可能与调节PTHrP、TGF－β、BSP的表达有关。