奶酪中高产β-半乳糖苷酶菌株的筛选及发酵条件的优化

黄倩，李洁，郑晓春，王斌，史学伟

(石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832000)

β-半乳糖苷水解酶(EC.3.2.1.23)又称β-D-半乳糖苷水解酶和乳糖酶，它能催化乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，具有转糖苷作用，是一种无毒无害的工业酶；在食品、医药、饲料、环保等众多领域都有广泛的应用[1]，可作为食品添加剂以防止浓缩乳制品结晶等。目前，植物和动物来源的乳糖酶生产工艺复杂、商业成本高；而微生物来源的酶产量高、周期短、生产成本低，广泛应用的微生物主要是酵母菌和霉菌[2]。但霉菌来源的乳糖酶利用范围比较窄，而酵母菌生产的β-半乳糖苷酶在牛奶、甜乳清和中性pH乳制品等中一直被广泛应用。

由于许多儿童和成人体内缺乏能够分解乳糖的乳糖酶，饮用牛乳后常常会引起消化不良，严重者会引起腹泻、呕吐等不适症状，乳糖酶的应用能很好地解决这一问题。因此，如何筛选得到酶学性质更为优良的菌株尤为重要。微生物中酶的产量主要受发酵的物理参数如温度、pH、培养时间和培养基组成碳源和氮源的影响较大。利用响应面(response surface methodology，RSM)试验设计可以更好地优化和确定β-半乳糖苷酶生产过程变量之间的相互作用[3-4]。除筛选影响发酵乳杆菌产生β-半乳糖苷酶的营养因子外，许多作者研究了β-半乳糖苷酶生产中pH、搅拌速度、底物浓度、温度和发酵时间等因素的作用[5]。因此，本研究根据水解酶活的高低从奶酪中筛选出一株高产乳糖酶的菌株，采用响应面分析的方法对该菌株的产酶条件进行优化，旨在快速高效地增强菌株的产酶能力，为酶学特性的进一步研究提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

奶酪：采自新疆哈萨克族牧民家，由石河子大学食品学院实验室保存；5-溴-4-氯-3-吲哚基吡喃半乳糖苷(X-Gal)：购自Takara公司；邻硝基苯酚(ONP)和邻硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)：购自上海浩弘化工有限公司；国内乳糖、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂、NaCl、MnSO4、MgSO4、NaH2PO4、Na2HPO4等：由实验室提供。

1.2 培养基

YPD筛选培养基(g/L)：乳糖10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，X-Gal 0.002，pH为7.0，固体培养基加琼脂20。

YPD斜面培养基(g/L)：乳糖10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，琼脂20，pH为7.0。

YPD种子液发酵培养基(g/L)：乳糖10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，CaCl20.1，MnSO40.001，MgSO40.3，KH2PO40.05，pH 7.0。

1.3 仪器与设备

DY000500酶标仪 苏州药明康德新药开发有限公司；JY92-IIN细胞破碎仪 上海比朗仪器制造有限公司；YXQ-LS-SⅡ灭菌锅 济南思卓医疗器械有限公司；THZ-300恒温培养摇床 上海一恒科学仪器有限公司；TGL-16G离心机 上海安亭科学仪器厂；5810R高速冷冻离心机 德国Eppendorf仪器公司；TC-512 PCR扩增仪 英国Techne公司；PowerPac Universal电泳仪、Gel DOC XR凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；CX21FS1光学显微镜 Olympus公司。

1.4 产β-半乳糖苷酶菌株的分离筛选及纯化

1.4.1 菌株的筛选和纯化[6]

1.4.1.1 富集培养

将奶酪样品配制成15%悬浮液，将5%悬浮液接种到YPD筛选培养基中，加入适量的玻璃珠。在30 ℃、转速为150 r/min的条件下孵育24 h。

1.4.1.2 筛菌

将获得的细菌液稀释至不同的浓度，在10-3～10-5的稀释度中，将0.05 mL悬浮液涂布于YPD固体培养基，并在30 ℃培养箱中倒置培养24 h。

1.4.1.3 纯化

挑取单菌落在YPD平板上划线以分离和纯化菌株，并多次划线纯化以得到菌落形态大小、色泽一致的菌株进行斜面保藏。

1.4.1.4 蓝白斑筛选

纯化后挑取单菌落接种到含有20 mg/mL X-Gal的固体YPD培养基平板中，在30 ℃培养箱中培养24 h，将产生蓝斑的菌株进行甘油管保藏。

1.5 高产β-半乳糖苷酶菌株的筛选及鉴定

1.5.1 粗酶液的制备

根据宋园亮等[7]测定乳糖酶的方法，将新鲜的种子液按3%的接种量接种于液体发酵培养基中，在30 ℃、200 r/min下培养24 h后，于4 ℃、8000 r/min下离心10 min，收集上清液即为胞外粗酶液；收集湿菌体，再用50 mmol/L、pH 7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液制成菌体悬浮液，然后利用超声细胞粉碎仪进行破壁，超声破碎条件：破碎效率75%，温度4 ℃，破碎时间5 min，破碎6 s间歇3 s。破碎后的菌悬液经4 ℃、8000 r/min冷冻离心后收集上清液，即为胞内β-半乳糖苷酶粗酶液，保存在4 ℃冰箱中备用。

1.5.2 酶活测定

将粗酶液置于37 ℃的水浴锅中温育10 min后取50 μL于酶标板中，每个样取3次求平均值。加入经37 ℃预热的20 mmol/L的ONPG 50 μL，并于37 ℃下反应10 min，最后吸取200 μL 0.5 mol/L的Na2CO3终止反应，于420 nm下测吸光度值。挑选出酶活最高的一株做后续优化试验。

酶活定义：每毫升粗酶液在每分钟内催化底物ONPG生成1 μmol ONP所需的酶量为1个酶活单位(U)，酶活计算公式：

式中：M为在试验条件下1 μmol/mL ONP的吸光度值；V1为反应混合液总体积(mL)；N为稀释倍数；t为反应时间(min)；V2为酶液体积(mL)。

1.5.3 标准曲线的制作

取139.0 mg的ONP放入烧杯中，加入10 mL 95%乙醇溶解，最后采用pH为7.0的PBS缓冲液于1000 mL的容量瓶中定容并颠倒混匀。

分别吸取定容好的溶液 2，4，6，8，10，12，14 mL于100 mL容量瓶中，用1%碳酸氢钠定容混匀，以PBS缓冲液为空白，于420 nm波长处测吸光度，得到ONP浓度曲线[8]。

1.5.4 26S rDNA PCR鉴定

菌体DNA的提取采用天根真菌DNA 提取试剂盒，根据试剂盒提供药品以及说明书步骤进行DNA的提取。

引物：ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)；

ITS2(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。

反应体系(25 μL)：DNA模板2 μL，上、下游引物(25 μmol/L)各0.5 μL，2×Taq DNA聚合酶12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。

PCR反应条件：预变性94 ℃，5 min；变性94 ℃，30 s，退火55 ℃，30 s，延伸72 ℃，3 min，共循环30次；最后延伸72 ℃，10 min。结束后，将产物在1%琼脂糖凝胶电泳上检测，观察结果后测序[9]。

将符合标准的26S rDNA扩增产物进行测序。测序结果用NCBI(National Center for Biotechnology Information)Blast进行同源序列比对，根据结果，用Claustal X1.83软件对下载的相似性为99%以上菌种的26S rDNA序列和测序菌株的序列进行多序列比对，结果采用Mega 6.0软件中的邻近法(Neighbor-Joining)进行系统发育树的构建，并对进化树采用Bootstrap进行1000次置信度分析[10]。

1.6 单因素试验

1.6.1 温度

将4 ℃保存的粗酶液分别置于27，37，45，55，65，75，85 ℃下温育10 min后于420 nm下测吸光度值[11]。每个试验组设3次重复，以平均值做统计分析。

1.6.2 pH

将粗酶液用pH为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0的PBS缓冲溶液制成悬浮液，破壁离心后测定其酶活。

1.6.3 破壁时间

将PBS制成的悬浮液分别进行破壁，破壁时间为2，5，8，11，14，17，20 min，之后测定其在420 nm波长下的吸光度值。

1.6.4 乳糖浓度

分别在培养基中加入0，5，10，15，20，25，30 g/L的乳糖进行摇床培养，破壁后测定其酶活，每组数据取3次平行。

1.6.5 金属离子

分别在培养基中加入0.01 mol/L的Na+、K+、NH4+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+于30 ℃，200 r/min下摇床培养24 h后测定其酶活，然后将促生长因子的浓度调为0.001，0.002，0.003 g/L。

1.6.6 接种量

以1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的接种量将种子液接入液体摇瓶培养基中摇床培养后测定其吸光度值。

1.7 产酶条件的优化

1.7.1 Plackett-Burman试验设计筛选显著因素

在单因素试验的基础上采用Plackett-Burman设计方法，对影响产酶的6个因素进行考察，即乳糖浓度、细胞破碎时间、初始pH值、破壁时间、温度和金属离子。每个因素采用高、低2个水平，分别记为1，-1，以乳糖酶相对活性为响应值，设定3个平行试验，各因素试验设计见表1。

1.7.2 最陡爬坡试验

在对Plackett-Burman设计结果分析的基础上，以效应值的正负为爬坡方向，以效应值的大小确定变化步长，逼近最大响应区域[12]。其他因素的取值由各因素效应值的正负和大小决定，正效应的因素取高水平值，负效应的因素取低水平值。

1.7.3 响应面(RSM)分析

通过Plackett-Burman试验及最陡爬坡试验确定响应面分析的这几个因素及其中心点[13]，然后采用Box-Behnken中心组合设计三因素三水平的试验，优化该菌株产β-半乳糖苷酶的条件，并在最佳的产酶条件下进行3次平行试验，证实响应面的可靠性。

1.7.4 数据处理与分析

采用Design Expert 8进行响应面分析，Plackett-Burman试验设计因素水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计因素水平Table 1 The factors and levels of Plackett-Burman test design

2 结果与分析

2.1 蓝白斑筛选

将奶酪样品稀释通过涂布挑菌纯化后，在筛选纯化所得到的菌株中，通过添加X-Gal进行蓝白斑筛选得到9株产β-半乳糖苷酶的菌株，见图1 。

图1 蓝白斑初筛结果Fig.1 The blue-white preliminary screening results

由图1可知，具有产乳糖酶的菌株会呈现蓝色，产酶的能力不同，呈现的颜色深浅不一样，其中y-2的蓝斑颜色最深，说明其产乳糖酶的能力可能很高，而菌株y-4、y-7、y-8产乳糖酶的能力较低。

2.2 水解酶活测定及菌种鉴定

通过测定9株菌株中产乳糖的能力，得到胞内和胞外的水解酶活，见图2。

图2 胞内和胞外酶活Fig.2 The intracellular and extracellular enzyme activities

由图2可知，y-8和y-9的胞内酶活和胞外酶活相差不大，其他几株菌的胞内酶活都在250 U/mL 以上，且都显著比胞外酶活高，说明β-半乳糖苷酶主要以胞内酶的形式存在于菌株内。胞内酶活中y-2的酶活最高，达到了382 U/mL其次是y-1，为362 U/mL，y-8和y-9的酶活最低，分别为78，82 U/mL；胞外酶活中y-6的酶活最高，为106 U/mL，y-8的酶活最低，为72 U/mL。

26S rDNA序列扩增的片段长度为750 bp，PCR扩增结果见图3中A。在GenBank上进行Blast比对，从GenBank中得到序列相近的参比菌株，采用临近法以Mega 6.0构建系统发育树，见图3中B。

图3 PCR扩增结果(A)及其系统发育树的构建(B)Fig.3 The PCR amplification results (A) and construction of its phylogenetic tree(B)

由图3中B可知，y-1、y-4、y-5、y-6、y-7与乳酸克鲁维酵母的亲源性较高，y-2、y-3属于马克斯克鲁维酵母，y-8、y-9是库德里阿兹威氏毕赤酵母。

2.3 单因素试验

根据水解酶活的高低挑选出菌株y-2做单因素试验，由图4可知，通过将粗酶液在不同温度下温育后测定相对酶活发现，37 ℃的相对酶活最高，表明β-半乳糖苷酶的最适温度为37 ℃，随着温度的升高，酶活逐渐下降，这是由于高温破坏了酶的分子结构，导致酶发生了变性，所以活性降低[14]。β-半乳糖苷酶的最适pH为7，表明β-半乳糖苷酶是一种中性酶。

图4 不同温度和pH下的相对酶活Fig.4 The relative enzyme activities at different temperatures and pH values

由图5可知，破壁时间为5 min时的酶活最高，但随着破壁时间的延长，酶活越低，这可能是酶在破壁过程中丧失；与空白对照相比，金属离子Na+、K+、NH4+是促生长因子，而其他的金属离子与空白相比反而抑制了菌的生长。

图5 不同破壁时间和金属离子下的相对酶活Fig.5 The relative enzyme activities at different wall breaking time and metal ions

由图6可知，乳糖浓度为10 g/L时的相对酶活最高；接种量较大导致大量菌体繁殖，迅速消耗培养基中的营养物质，不利于菌株产酶[15]。由此，可以初步确定菌株产酶的最适接种量为4%。

图6 不同乳糖浓度和接种量下的相对酶活Fig.6 The relative enzyme activities at different lactose concentration and inoculation amount

由图7可知，Na+的浓度为0.001 g/L时的相对酶活最高，这是因为金属离子的浓度增高反而会对菌的生长产生副作用，从而抑制乳糖酶的相对含量。

图7 Na+的浓度对酶活的影响(A)及ONP标准曲线(B)Fig.7 The effect of Na+ concentration on enzyme activity (A) and the standard curve of ONP(B)

2.4 Plackett-Burman 设计筛选结果

在6个单因素试验的基础上，采用 Plackett-Burman设计创建试验次数N=12的试验，对6个因素进行考察。每个因素取高水平和低水平2个水平，以乳糖酶相对活力为响应值，试验设计及结果见表2。

表2 Plackett-Burman(PB)试验设计与响应值结果Table 2 Plackett-Burman (PB) test design and response value results

续 表

由表3可知，Prob>T值(P值) 的大小表明各个考察因素的显著水平，当Prob>T值<0.05 时表明各因素有显著影响。6个因素中pH、温度、乳糖浓度对产酶的影响极显著，显著性比较：pH>温度>乳糖浓度。后续的试验中其他3个因素均选取最优值进行。

表3 Plackett-Burman试验设计的各因素水平及显著性分析Table 3 The analysis of the factors and significance of each factor in Plackett-Burman test design

2.5 最陡爬坡试验结果

在单因素试验结果的基础上，以SPSS软件对P-B设计方法的试验数据进行了统计分析，结果发现各因素中影响显著性的因素是pH、温度、乳糖浓度。因此，pH、温度、乳糖浓度对乳糖酶酶活存在着较显著的影响，确定其为下一步试验设计的关键因素。根据筛选出3个主要影响因素的效应和大小比例，设定最陡爬坡试验的变化方向和步长，试验设计及结果见表4。

表4 最陡爬坡试验设计及其结果Table 4 The steepest climbing test design and the results

2.6 响应面设计及结果分析

2.6.1 Box-Behnken中心组合试验设计

响应面设计及回归模型的建立在Plackett-Burman试验设计及最陡爬坡试验的基础上确定了几个主要影响因素及响应面试验的中心点，采用Box-Behnken中心组合设计对pH、温度、乳糖浓度进行三因素三水平的响应面分析试验，试验设计与结果见表5和表6，该响应面试验共有15个试验点，其中1～12为分析点，13～15为零点，每个重复3次以评估试验的误差。

表5 Box-Behnken试验设计的因素与水平Table 5 The factors and levels of Box-Behnken test design

表6 Box-Behnken试验设计及结果Table 6 The Box-Behnken test design and results

2.6.2 响应面设计及回归模型

运用Design Expert 8软件对试验所得数据进行回归分析，以乳糖酶相对酶活(Y)为因变量，pH (X1)、温度(X2)和乳糖浓度(X3)为自变量建立回归方程：

Y = 96.17-0.11X1-0.4X2-0.74X3+4.32X1X2+0.79X1X3-1.60X2X3-7.97X12-4.78 X22-2.10 X32。

对该方程进行回归系数显著性检验和方差分析，见表7和表8。

表7 回归系数显著性检验Table 7 The significance test of the quadratic model's regression coefficients

续 表

表8 回归方程的方差分析Table 8 The variance analysis of regression equation

由表7可知，一次项中3个因素对酶活力的影响排序为：温度>pH>乳糖浓度，且Prob>T表明对Y值的影响显著；二次项中X1，X2显著，X3不显著；交互项中X1X2对酶活力显著，X1X3、X2X3对酶活力不显著。说明单因素、各单因素平方对酶活影响较大，各因素间的交互作用影响较小。回归系数R2=93.25%>91.62%，表明该模型摸拟不同因素对菌株y-2产β-半乳糖苷酶酶活的影响效果较好，试验过程设计合理，该模型成立。

由表8可知，失拟项数值为0.361，远大于0.05，说明失拟不显著，该模型稳定，可以作为不同因素水平对酶活影响的预测。

2.6.3 响应面分析

利用软件对数据进行拟合，得到响应面及等高线图，见图8～图10。

图8 温度与pH对β-半乳糖苷酶相对酶活的等高线图和响应面立体分析图Fig.8 The contour and response surface analysis diagrams of interaction effect of temperature and pH on the relative activity of β-galactosidase

图9 温度与乳糖浓度对β-半乳糖苷酶相对酶活的等高线图和响应面立体分析图Fig.9 The contour and response surface analysis diagrams of interaction effect of temperature and lactose concentration on the relative activity of β-galactosidase

图10 pH与乳糖浓度对β-半乳糖苷酶相对酶活的等高线图和响应面立体分析图Fig.10 The contour and response surface analysis diagrams of interaction effect of pH and lactose concentration on the relative activity of β-galactosidase

由图8～图10可直观地看出各因子对响应值的影响变化趋势，并且模型确实存在最大值。从等值线图可以看出存在极值的条件应该在圆心处。等高线的形状可以反映交互效应的大小，椭圆形表示两个因素的交互作用显著，圆形表示两个因素的交互作用不显著。pH和温度、pH和乳糖浓度对酶活的交互作用显著；温度和乳糖浓度对酶活的交互作用显著性不明显。

3 结论

通过对新疆哈萨克族奶酪中的菌株进行筛选和纯化，然后添加显色剂最终筛选得到9株产乳糖酶的菌株，经过水解酶活测定和菌种鉴定，得到一株高产乳糖酶的菌株y-2，鉴定为马克斯克鲁维酵母，根据温度、pH、破壁时间、乳糖浓度、金属离子和接种量这6个单因素试验设计结果，利用Plackett-Burman试验设计和最陡爬坡试验结果发现显著性的因素是pH、温度、乳糖浓度，最后通过响应面分析得出pH和温度、pH和乳糖浓度对酶活的交互作用显著；温度和乳糖浓度对酶活的交互作用显著性不明显。