大蒜素的提取及抑菌效果研究

刘丽珍，甄莉娜，崔乃忠，白志强

(1.山西大同大学 生命科学学院，山西 大同 037009；2.山西大同大学应用生物技术研究所，山西 大同 037009)

大蒜是百合科葱属植物蒜的鳞茎部分[1]，作为食药同源植物富含营养物质和必需氨基酸，被人们广泛使用[2]。紫皮大蒜为富硒农产品，具有杀菌抗菌、抗癌抗突变、增加生物活性、减少心脑血管疾病、调节机体免疫能力等功效，被誉为“天然抗生素”[3-5]。《本草纲目》中记载，大蒜可以祛风湿、除风邪、止衄血、通五脏、治泄泻、止霍乱及散痈肿[6-7]。新鲜的大蒜不含生物活性物质大蒜素，以不稳定的蒜氨酸形式存在[8]。王希丽等[9]研究表明，白皮蒜有26种挥发性成分，而紫皮蒜有35种。大蒜被捣碎后，蒜氨酸经蒜氨酸酶的催化生成了大蒜素[10]。侯志敏等[11]研究表明，紫皮大蒜的大蒜素含量高，抑菌作用明显，而且对细菌病毒均有杀灭和抑制作用[12]。

目前，大蒜素的提取方法有水蒸气蒸馏法、有机溶剂法、真空微波萃取法和超临界萃取法。水蒸气蒸馏法设备简易、方便操作、稳定性好、成本低，但高温会使蒜酶失活，导致大蒜素的产率降低[13]；有机溶剂法提取设备简易，操作方法简便，大蒜素提取产率较高，广泛用于食品药品领域[14]；真空微波萃取法操作简单，提取率高，但高温易使大蒜素分解；超临界萃取法安全可靠，提取大蒜素的产率非常高，不易破坏原产物，但成本高、不易操作，用于制备高附加值的食品。本试验以山西应县紫皮蒜为材料，采用有机溶剂法提取大蒜素，结合单因素试验和正交试验选出最佳提取条件；之后将较常见的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别接种到含有大蒜素的培养基中，以探讨大蒜素对两种细菌的作用，为食品药品和医学方面的研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

紫皮大蒜：应县产；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌：由山西大同大学生命科学学院微生物实验室提供。

1.2 仪器

JA5003B型分析天平 上海精科天美科学仪器有限公司；A-88型组织捣碎机、GZX-250-D型光照培养箱、DK-8D型数显恒温水浴锅 金坛国旺实验仪器厂；HC-2062型台式高速离心机 安徽中科中佳科学仪器公司；RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；9070MBE型电热鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 大蒜的选取及提取工艺

选取大小均匀、瓣肉洁白、无病虫害、无机械破损的紫皮大蒜。去皮后用无菌水清洗干净，捣碎成泥状，40 ℃酶解30 min，离心15 min，取上清液过滤、除菌、分装于高压灭菌后的离心管中备用。

1.3.1.1 料液比对大蒜素提取的影响

准确称取样品6份，每份5 g，40 ℃酶解30 min，加入95%的乙醇溶液，40 ℃水浴1 h，设置料液比为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，离心取上清液，每个样品重复3次，观察不同料液比下大蒜素的提取率。

1.3.1.2 乙醇浓度对大蒜素提取的影响

准确称取样品6份，每份5 g，40 ℃酶解30 min，加入不同浓度的乙醇溶液20 mL，40 ℃水浴1 h，设置乙醇浓度分别为45%、55%、65%、75%、85%、95%，离心取上清液，每个样品重复3次，观察不同乙醇浓度下大蒜素的提取率。

1.3.1.3 提取温度对大蒜素提取的影响

准确称取样品6份，每份5 g，40 ℃酶解30 min，加入85%的乙醇溶液20 mL，水浴1 h，设置温度分别为20，25，30，35，40，45 ℃，离心取上清液，每个样品重复3次，观察不同提取温度下大蒜素的提取率。

1.3.1.4 提取时间对大蒜素提取的影响

准确称取样品6份，每份5 g，40 ℃酶解30 min，加入85%的乙醇溶液20 mL，30 ℃分别水浴0.5，1，1.5，2，2.5，3 h后，离心取上清液，每个样品做3次重复，观察不同提取时间下大蒜素的提取率。

1.3.2 制备菌悬液

采用牛肉膏蛋白胨培养基接种大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，置于37 ℃培养箱24 h，分别置于0.9%的生理盐水中制成菌悬液进行试验。

1.3.3 测定抑菌能力

将打孔灭菌处理过的滤纸片置于大蒜提取液中,浸泡50 min。放入含有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的平板里，待菌液全部吸收入培养基内，于恒温培养箱37 ℃培养24 h观察抑菌圈直径，每种菌重复3次取平均值。

1.3.4 测定最小抑菌浓度(MIC)

用无菌蒸馏水2倍稀释大蒜素原液，浓度为500，250，125，62.5，31.25，15.625 mg/mL 6个不同梯度，分别浸泡滤纸片到含有1.3.3菌的培养基中，每种重复3次。

1.4 正交试验

在料液比、乙醇浓度、提取温度和提取时间 4个单因素中，分别选取3个影响最大的因素为水平，做 L9(34)正交试验，重复3次，以考察大蒜素的最佳提取条件。

2 结果与分析

2.1 因素试验结果

2.1.1 料液比对大蒜素提取率的影响

由图1可知，随着料液比的加大，大蒜素的提取率逐渐增加，当料液比为1∶4时，提取率为最大值，继续添加乙醇量，大蒜素的提取率反而开始下降。因此在做正交试验时，选取料液比1∶3、1∶4、1∶5做3个水平。

图1 料液比对大蒜素提取率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of allicin

2.1.2 乙醇浓度对大蒜素提取率的影响

由图2可知，随着乙醇浓度的升高，大蒜素的提取率不断增加，并且在浓度为85%时达到最大值，当浓度大于85%时，大蒜素的提取率开始下降。可能是因为浓度较低时，大蒜素未被乙醇完全萃取，而影响大蒜素向有机相转移，溶剂体积分数增大，有利于大蒜素的提取，达到饱和时，大蒜素不稳定，开始分解。因此在做正交试验时，选取乙醇浓度75%、85%、95%做3个水平。

图2 乙醇浓度对大蒜素提取率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of allicin

2.1.3 提取温度对大蒜素提取率的影响

由图3可知，大蒜素的提取率随着提取温度的升高而不断增加，在温度为35 ℃时，大蒜素的提取率最高；随着温度的继续上升，大蒜素的提取率呈下降趋势。可能是由于低温时，蒜氨酸酶的活性较低，影响大蒜素向有机相的转移；温度继续上升加快了分子的热运动，酶的活性也达到最大，提取率最高；但过高的温度会导致大蒜素不稳定而分解，逐渐转化成其他物质，而使大蒜素的含量减少。即蒜氨酸酶的活性随着温度的升高而增强，达到一定程度时，活性趋于平稳，之后温度继续升高，酶的活性反而下降直到失活状态。因此在做正交试验时，选取提取温度30，35，40 ℃做3个水平。

图3 提取温度对大蒜素提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield of allicin

2.1.4 提取时间对大蒜素提取率的影响

由图4可知，大蒜素的提取率随着提取时间的延长不断增加，时间为1.5 h时，大蒜素的提取率达到峰值，之后大蒜素的提取率不随时间的延长而增加，反而下降。原因可能是开始时提取时间较短，蒜氨酸不能完全分解为大蒜素；但时间过长时，已生成的大蒜素或已挥发或已转化成其他物质。因此在做正交试验时，选取提取时间1，1.5，2 h做3个水平。

图4 提取时间对大蒜素提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield of allicin

2.2 正交试验结果

综合单因素试验结果，以料液比、乙醇浓度、提取温度、提取时间为考察因素，以大蒜素提取率为指标，做4因素3水平正交试验，重复3次，结果见表1。

由表1～表3可知，提取大蒜素的最佳条件为A3B2C3D2，即料液比为1∶5，乙醇浓度为85%，提取温度为40 ℃，提取时间为1.5 h时，大蒜素的提取率最大。由极差值R可知，有机溶剂提取法提取紫皮大蒜中大蒜素的影响顺序为A>B>D>C，即料液比的影响最大，乙醇浓度的影响次之，提取温度的影响最小。4个因素对大蒜素的提取率影响不显著。用优化的组合重复3 次做验证试验，得出的提取率为0.43%。

表1 L9(34)正交试验因素水平表Table 1 The factors and levels of L9(34) orthogonal test

表2 正交试验结果Table 2 The results of orthogonal test

表3 方差分析表Table 3 The analysis of variance

2.3 大蒜素的抑菌结果

大蒜素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌结果见表4和表5。

表4 大肠杆菌的抑菌圈直径Table 4 The bacteriostatic zone diameter of of Escherichia coli

表5 金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径Table 5 The bacteriostatic zone diameter of Staphylococcus aureus

由表4和表5可知，紫皮大蒜中大蒜素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，且抑菌圈直径随着大蒜素浓度的增加而增大。这可能是由于大蒜素中的含硫活性基团与细菌生长所必需的半胱氨酸中的巯基结合，竞争性地抑制了细菌生长繁殖[15]。Fujisawa H等[16]认为，大蒜素的抗菌能力是其释放的氧原子或烯丙基巯基与细菌中的巯基酶相互作用的结果。

2.4 最小抑菌浓度

由表6可知，大蒜素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用，最小抑菌浓度分别为62.5，31.25 mg/mL，且大蒜素对金黄色葡萄球菌的抑制作用明显强于大肠杆菌，这与姚芹等[17]、尚丛珊等[18]的研究结果一致，且抑菌效果随浓度的增大而增加。

表6 大蒜素的最小抑菌浓度Table 6 The minimum inhibitory concentration of allicin

3 结论

根据单因素试验和正交试验结果得出：当乙醇浓度为85%，料液比为1∶5，提取温度为40 ℃，提取时间为1.5 h时，大蒜素的提取率最大，为0.43%。大蒜素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用，最低抑菌浓度分别为 62.5，31.25 mg/mL，且对金黄色葡萄球菌的抑制作用强于大肠杆菌，该试验结果为大蒜素的进一步研究提供了理论基础。