miR-33b靶向上游转录因子1基因调控喉癌细胞的作用机制

倪 红，周兴星，喻慧岭

0 引 言

喉癌是临床常见头颈部恶性肿瘤之一，喉鳞状细胞癌是喉癌的主要病理类型，既往研究显示吸烟、饮酒等环境因素与喉癌发病密切相关[1-2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一种非编码小RNA，并可通过调控下游靶基因表达从而参与多种生理病理过程[3]。部分miRNA在喉癌发生发展过程中发挥抑癌或促癌作用[4]。但仍有部分miRNA在喉癌发生及转移过程中的调控机制尚未阐明。微小RNA-33b(microRNA-33b，miR-33b)在骨肉瘤细胞中呈低表达，上调其表达可通过靶向乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A，LDHA)而抑制骨肉瘤细胞增殖[5]。miR-33b可通过靶向抑制高迁移率族蛋白A2(high mobility group protein A2，HMGA2)的表达而抑制食管鳞状细胞癌迁移及侵袭[6]。但miR-33b在喉癌发生及转移过程中的作用机制尚未可知。靶基因预测网站Targetscan预测显示上游转录因子1(upstream transcription factor 1，USF1)可能是miR-33b的靶基因，USF1在胃癌、宫颈癌等肿瘤中呈高表达并可促进肿瘤的发生及发展[7-8]；但miR-33b是否可通过靶向调控USF1而参与喉癌发生发展过程尚未明确。本研究主要探讨miR-33b、USF1在喉癌组织及细胞中的表达，观察miR-33b过表达、沉默USF1表达后喉癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的变化，分析miR-33b与USF1在喉癌发生及转移过程中的靶向调控作用，为揭示喉癌发病机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂正常支气管上皮细胞16HBE与喉癌细胞TR-LCC-1均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。杜氏改良培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)均购自上海玉博生物科技有限公司。甲基噻唑基四唑(MTT)、二 喹 啉 甲 酸(BCA)蛋白定量检测试剂盒、二甲基亚砜(DMSO)均购自上海晶抗生物工程有限公司；miR-33b模拟物(mimics)及阴性对照(miR-con)、USF1小干扰RNA(si-USF1)、乱序无意义阴性序列(si-con)、miR-33b特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-33b)及阴性对照(anti-miR-con)均购自广州锐博生物科技有限公司；细胞凋亡试剂盒购自北京博尔迈生物技术有限公司；Transwell小室购自北京优尼康生物科技有限公司；Matrigel基质胶购自北京索莱宝科技有限公司；pcDNA3.1与Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；Trizol、逆转录及实时荧光定量PCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司；荧光素酶报告基因载体购自南京中洪博元生物科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；兔抗人Ki-67、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、B淋巴细胞瘤-2 (Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)抗体均购自美国Santa cruz公司；兔抗人USF1抗体与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自美国Abcam公司。

收集2016年5月至2018年6月华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院的43例喉癌组织标本及癌旁组织标本，置于-80 ℃超低温冰箱保存。

1.2方法

1.2.1 细胞培养、转染及实验分组16HBE细胞与TR-LCC-1细胞培养于含有10%FBS的DMEM培养基，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱内，待细胞生长密度达到85%左右时进行传代。取对数生长期TR-LCC-1细胞接种于6孔板，待细胞生长融合度达到70%时进行转染，参照Lipofectamine2000试剂说明书进行操作，实验分组：正常组(常规培养的TR-LCC-1细胞)、miR-con组(miR-con转染至TR-LCC-1细胞)、miR-33b组(miR-33b mimics转染至TR-LCC-1细胞)、si-con组(si-con转染至TR-LCC-1细胞)、si-USF1组(si-USF1转染至TR-LCC-1细胞)、miR-33b+pcDNA组(miR-33b mimics与pcDNA共转染至TR-LCC-1细胞)、miR-33b+ pcDNA-USF1组(miR-33b mimics与pcDNA-USF1共转染至TR-LCC-1细胞)，转染前1 h将培养液更换为不含FBS的培养基，转染6 h更换为含有FBS的培养基继续培养48 h，收集细胞进行后续实验。

1.2.2qRT-PCR检测细胞中miR-33b、USF1 mRNA表达水平采用Trizol法提取喉癌组织、癌旁组织及细胞总RNA，应用紫外分光光度计测定RNA质量，按照反转录试剂盒操作合成cDNA。miR-33b正向引物5′-ATTCTTTCGAACTGTCTTGG-3′，反向引物5′-TCACCTTCGGCTGTCCTGACA-3′；U6正向引物5′-AGTACCAGTCTGTTGCTGG-3′，反向引物5′-TAATAGACCCGGATGTCTGGT-3′′；USF1正向引物5′′-CTACCCTGCCACTCAATCCA-3′，反向引物5′-AGAATTGACCAGTGCCAGGA-3′；β-actin正向引物5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′，反向引物5′-TGATGTCACGCACGATTT-3′，引物均由上海生物工程股份有限公司合成。按照qRT-PCR检测试剂盒说明书配反应体系，置于ABI 7500实时荧光定量PCR仪检测，反应条件：95 ℃预变性5 min循环1次，95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，共循环40次。miR-33b以U6为内参，USF1以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-33b、USF1 mRNA相对表达量。

1.2.3MTT检测细胞增殖取对数生长期喉癌TR-LCC-1细胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培养基制备细胞悬液，接种于96孔板，每孔5×103个细胞，按照1.2.1实验分组，每孔加入20 μL MTT溶液，继续培养4 h，弃上清，加入150 μL DMSO，应用酶标仪检测各孔在波长为490 nm处的相对吸光度值(A)，计算细胞存活率。每组设置3次重复。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡收集各组TR-LCC-1细胞，PBS清洗，加入500 μL Binding Buffer悬浮细胞，加入5 μLAnnexin V-FITC与5 μL PI，室温避光孵育10 min，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5Transwell实验检测细胞迁移及侵袭细胞侵袭实验：稀释Matrigel基质胶，Transwell小室底部的上室面加入Matrigel基质胶(100 μL/孔)，收集各组转染TR-LCC-1细胞，重悬细胞(2×105/mL)，按照每孔200 μL的密度加入Transwell小室上室，Transwell小室下室加入600 μL含FBS的DMEM培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱继续培养24 h，采用多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤，结晶紫溶液染色15 min，PBS洗涤，显微镜下观察侵袭细胞数。细胞迁移实验：Transwell小室上室中无需加入Matrigel基质胶，后续实验步骤同细胞侵袭实验，实验结束后置于显微镜下观察迁移细胞数。

1.2.6荧光素酶报告基因检测 miR-33b靶基因Targetscan预测显示miR-33b与USF1存在结合位点，将含有结合位点与突变位点的片段插入荧光素酶报告基因载体分别构建野生型报告质粒WT- USF1与突变型报告质粒MUT- USF1，将WT- USF1、MUT- USF1分别与miR-con、miR-33b mimics共转染至TR-LCC-1细胞，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱继续培养48 h，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组荧光素酶活性。

1.2.7Western blot检测USF1、Ki-67、MMP-2、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达取冻存喉癌组织、癌旁组织以及对数生长期细胞，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，将30 μg蛋白样品与上样缓冲液充分混匀后点样，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，反应结束后转膜、封闭，加入蛋白一抗(USF1 1∶500、Ki-67 1∶800、MMP-2 1∶1000、Bcl-2 1∶5000、Bax 1∶5000、Cleaved caspase-3 1∶1000)，4 ℃孵育24 h，TBST洗膜，加入IgG二抗(1∶5000)，滴加ECL显影，置于自动凝胶成像系统分析各蛋白条带。

2 结 果

2.1 miR-33b和USF1在喉癌组织及喉癌细胞株中的表达与癌旁组织比较，喉癌组织中miR-33b的表达水平显著降低(P<0.05)，USF1 mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，见表1，图1。与正常支气管上皮细胞16HBE比较，喉癌细胞TR-LCC-1中miR-33b的表达水平显著降低(P<0.05)，USF1 mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，见图1，表2。

表 1 miR-33b和USF1在喉癌患者组织中癌旁组织和喉癌组织中的表达

1:癌旁组织; 2:喉癌组织; 3:16HBE; 4:TR-LCC-1

表 2 miR-33b和USF1在正常支气管上皮细胞16HBE和喉癌细胞TR-LCC-1的表达

2.2转染miR-33b对喉癌细胞TR-LCC-1增殖、迁移和侵袭的影响qRT-PCR检测结果显示，与miR-con组比较，miR-33b组喉癌TR-LCC-1细胞中miR-33b的表达水平显著升高(P<0.05)。提示成功上调喉癌TR-LCC-1细胞中miR-33b的表达。与miR-con组比较，miR-33b组喉癌TR-LCC-1的细胞存活率、细胞迁移数与细胞侵袭数显著降低(P<0.05)，Ki-67、MMP-2蛋白相对表达量亦显著降低(P<0.05)，见表3，图2。

表 3 转染miR-33b对喉癌细胞TR-LCC-1增殖、迁移和侵袭及Ki-67和MMP-2蛋白表达的影响

1:正常组; 2:miR-con组; 3:miR-33b组

2.3转染miR-33b促进喉癌细胞TR-LCC-1凋亡与miR-con组比较，miR-33b组喉癌TR-LCC-1细胞的细胞凋亡率、Bax、Cleaved caspase-3蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)，正常组与miR-con组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图3、图4，表4。

1:正常组; 2:miR-con组; 3:miR-33b组

图 4 流式细胞术检测喉癌细胞TR-LCC-1凋亡率

表 4 转染miR-33b对喉癌细胞TR-LCC-1中Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白及细胞凋亡率的影响

2.4miR-33b靶向调控USF1表达Targetscan预测显示miR-33b与 USF1 3′UTR存在靶向序列。双荧光素酶报告实验结果显示，转染野生型报告质粒WT- USF1的实验中，miR-33b组荧光素酶活性显著低于miR-con组(P<0.05)。转染突变型报告质粒MUT- USF1的实验中，miR-33b组与miR-con组荧光素酶活性相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表 5 双荧光素酶报告实验结果

2.5沉默USF1抑制喉癌细胞TR-LCC-1增殖、迁移、侵袭和诱导细胞凋亡与si-con组比较，si-USF1组喉癌TR-LCC-1细胞中USF1蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)，提示成功降低喉癌TR-LCC-1细胞中USF1的表达。见表6。与si-con组比较，si-USF1组喉癌TR-LCC-1细胞的细胞存活率、细胞迁移数与细胞侵袭数、Ki-67、MMP-2、Bcl-2蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05)，见表6，图5、图6。

表 6 沉默USF1对喉癌细胞TR-LCC-1中增殖、迁移、侵袭及细胞凋亡率的影响

1:正常组; 2:si-con组; 3:si-USF1组

图 6 流式细胞术检测喉癌细胞TR-LCC-1凋亡率

2.6过表达USF1和转染miR-33b对喉癌细胞TR-LCC-1增殖、迁移、侵袭和诱导细胞凋亡的影响结果显示，与miR-33b+pcDNA组比较，miR-33b+ pcDNA-USF1组喉癌TR-LCC-1细胞中USF1蛋白相对表达量、细胞存活率、细胞迁移数与细胞侵袭数、Ki-67、MMP-2、Bcl-2蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05)，见图7、图8，表7。

1:miR-con组; 2:miR-33b组; 3:miR-33b+pcDNA组; 4:miR-33b+pcDNA- USF1组

图 8 流式细胞术检测喉癌细胞TR-LCC-1凋亡率

表 7 过表达USF1部分逆转转染miR-33b对喉癌细胞TR-LCC-1的抑制作用

3 讨 论

miRNA可通过与靶基因的mRNA互补结合而抑制靶基因表达从而调控细胞增殖、分化及凋亡等生物学过程，研究表明部分miRNA已成为喉癌病理生理学研究的重点，并有望成为喉癌诊断的生物学标志物，还可能成为喉癌的治疗靶点[9-11]。但miR-33b在喉癌发生发展过程中的作用机制尚未可知，因此本研究主要探讨miR-33b在喉癌中的表达状态及其对喉癌细胞生物学行为的影响，为喉癌的基因治疗提供新靶点。

miR-33b在肝细胞癌组织中呈低表达，miR-33b过表达可能通过负向调控人类婆罗双树样基因4(SALL4)的表达而抑制肝细胞癌细胞增殖[12]。miR-33b在胰腺癌、肺癌、恶性黑色素瘤等肿瘤中表达水平降低，并可调控细胞增殖及转移[13-15]。本研究结果显示miR-33b在喉癌组织及其细胞中的表达水平显著降低，miR-33b过表达后喉癌细胞存活率显著降低，进一步研究发现Ki-67蛋白表达水平显著降低。Ki-67在喉癌中呈高表达，Ki-67可反映细胞的增殖程度，其表达量升高与肿瘤发生发展有关[16]。提示miR-33b可能通过抑制Ki-67的表达从而抑制喉癌细胞增殖。肿瘤迁移、侵袭与细胞内基质金属蛋白酶密切相关，其中MMP-2是基质金属蛋白酶家族成员之一，并可通过降解Ⅳ型胶原酶而破坏肿瘤细侵袭屏障从而促进肿瘤细胞转移[17]。本研究结果显示miR-33b过表达后喉癌细胞的迁移细胞数与侵袭细胞数均显著减少，MMP-2蛋白表达水平显著降低，提示miR-33b可抑制喉癌细胞迁移及侵袭。抗凋亡蛋白Bcl-2在喉癌中呈高表达，促凋亡蛋白Bax在喉癌中呈低表达[18]。本研究结果显示miR-33b过表达后喉癌细胞的细胞凋亡率显著升高，Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达水平显著升高，而Bcl-2蛋白表达水平显著降低，提示miR-33b可促进喉癌细胞凋亡。

USF1在黑色素瘤中呈高表达并可促进黑色素瘤细胞侵袭[19]。研究表明USF1可促进增强胶质母细胞瘤干细胞增殖[20]。相关报道指出USF1表达量升高与卵巢癌患者预后不良有关[21]。本研究结果显示USF1在喉癌组织及其细胞中的表达水平明显升高，进一步研究显示沉默USF1的表达后，喉癌细胞的细胞存活率显著降低，迁移与侵袭细胞数均显著减少，细胞凋亡率升高，并可促进Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达，抑制Ki-67、MMP-2、Bcl-2蛋白表达。提示沉默USF1可能通过上调Bax、Cleaved caspase-3的表达及下调Ki-67、MMP-2、Bcl-2的表达从而抑制喉癌细胞增殖、迁移及侵袭，促进细胞凋亡。本研究通过双荧光素酶报告实验与Western blot实验证实miR-33b靶向结合USF1并可负向调控USF1的表达，进一步研究结果显示USF1过表达联合miR-33b过表达后喉癌细胞增殖、迁移、侵袭能力明显增强，细胞凋亡率明显降低，提示miR-33b过表达可通过下调USF1的表达从而抑制喉癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，诱导细胞凋亡。

综上所述，miR-33b通过靶向USF1对喉癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭行为产生影响，miR-33b可能作为喉癌早期诊断及评估患者预后的肿瘤标志物，有望成为喉癌治疗的潜在靶点，可为喉癌治疗新途径提供理论依据。