心肌肥厚大鼠心肌组织及肥大心肌细胞中环状RNA rno_circRNA_016002表达观察

邱曼曼，费乔曼，武莉莉，王书影，杨冰，张玲

1 天津医科大学基础医学院，天津300070；2 中国人民武装警察部队后勤学院

心肌肥厚是随着心脏负荷增加而产生的一种适应性变化。生理性心肌肥厚常发生于运动员、孕妇等群体中，而长期肥厚性的刺激，如高血压、心肌炎等将会导致病理性心肌肥厚。病理性心肌肥厚可以导致细胞外胶原蛋白沉积、肾上腺素反应丧失，并且发生代谢异常，最终导致不可逆的结构性心脏重塑、细胞死亡、心衰等症状［1-2］。病理性心肌肥厚将会导致心肌细胞变大、肌节结构分离、蛋白质合成增强、胎儿基因，如ANP、BNP 等将会重新表达［3］。然而，心肌肥厚的分子生物学机制目前还未被完全阐明，需要更进一步的深入研究。

环状RNA 作为一种单链共价闭环遗传上高度保守的单链环状RNA，其在真核细胞中的表达具有细胞类型、组织乃至发育阶段的特异性［4］。由于环状RNA 没有5"或3"末端，其稳定性高于线性RNA，常规核酸外切酶可将其降解。多数环状RNA 并不具翻译编码蛋白质的能力，但是近期研究表明，一些环状RNA 也参与了蛋白质的合成［5-6］。环状RNA 可以作为吸收miRNA 的海绵，在转录水平和转录后水平起重要的调控作用。通过对心脏组织深度测序发现，在心脏组织中环状RNA 表达相对比较丰富，并且在心脏发育的不同阶段具有特异性表达，有可能成为心血管系统疾病特异性的生物标志物，但目前其在心血管领域中的研究少见［7-8］。环状RNA rno_circRNA_016002 位 于 第 八 号 染 色 体（chr8：14833006|14966744），在高血压大鼠模型中表达上调［9］，其在心肌肥厚的过程中是否起作用仍未可知。2019年3月—2020年6月，我们采用ISO诱导了心肌肥厚大鼠及肥大心肌细胞模型，观察了环状RNA rno_circRNA_016002在肥厚的心肌组织及肥大心肌细胞中的表达变化，并采用siRNA 干扰环状RNA rno_circRNA_016002 的表达水平，观察心肌肥厚标志物ANP 和BNP 的mRNA 和蛋白质在心肌细胞中的表达变化，以明确环状RNA rno_circRNA_016002在心肌肥厚过程中是否起调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、细胞、试剂、仪器 SPF 级SD 大鼠，120 ～150 g/ 只，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司。H9C2细胞系购自美国ATCC，DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA 购自GIBICO 公司，苏木与伊红染料购自北京索莱宝公司、Western及IP 细胞裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自英国abcam 公司，化学发光液采用Pierce 公司ECL Western bloting Substrate，TRIzol RNA 纯化试剂及Maxima Reverse Transcriptase 逆转录酶购自美国ThermoFisher Scientific 公司，RNase R 及BrightGreen qPCR MasterMix 购自加拿大ABM 公司。兔抗ANP单克隆抗体（abcam，ab189921），兔抗BNP 多克隆抗体（abcam，ab19645），小鼠抗GAPDH 单克隆抗体（abcam，ab8245），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（武汉爱博泰克生物科技有限公司，Catalog：AS014），辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠二抗（武汉爱博泰克生物科技有限公司，Catalog：AS003）超声心动图检测仪购自Toronto Canada，切片机购自德国LEICA，NanoDrop 2000 微量分光光度计购自美国ThermoFisher Scientific 公司，ABI 7500 实时荧光定量PCR 系统，BIO-RAD ChemiDoc XRS 凝胶成像系统，Thermo Forma 311直热式CO2细胞培养箱。

1.2 实验动物分组、大鼠心肌肥厚模型的建立及肥厚的心肌组织中rno_circRNA_016002的检测

SD 大鼠适应性饲养48 h 后，分为Control 组和ISO 组，每组6 只。ISO 组每天腹腔注射ISO 3 mg/kg，Control组注射同等体积的生理盐水，连续注射两周后，进行超声心动图检查，结果显示ISO 组大鼠发生了心肌肥厚。之后处死大鼠，取出心脏，除去多余的组织与血管，生理盐水灌注后进行组织包埋与切片，HE 染色显示ISO 组心肌细胞横截面积明显增大，证明大鼠心肌肥厚造模成功。

肥厚的心肌组织中rno_circRNA_016002 的检测采用实时定量PCR 法。50 mg 大鼠心肌组织（切碎后）加入至1 mL TRIzol 试剂中，按照试剂说明书进 行。circRNA 的 纯化，10 μg 总RNA 采用2 μL RNase R（10 U/ μL）37 ℃消化3 h。逆转录采用随机引物作为逆转录引物，使用Maxima Reverse Transcriptase 逆转录酶，按照其说明书进行。实时定量PCR 按照BrightGreen qPCR MasterMix 说明书操作。实时定量PCR 反应条件为50 ℃2 min；95 ℃5 min；95 ℃15 s，60 ℃40 s，40 个循环。采用2-ΔΔCt法计算基因mRNA 表达水平。每个样品采用3 个复孔，实验重复3 次。实时定量PCR 所使用引物如下：rno_circRNA_016002 上游引物为5"CGGGGATCCAACTTCCAGTG3"，下 游 引 物 为5"ACCTGCATGTGATTGCCCTAT3"；GAPDH 上游引物为5"TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC3"，下游引物为5"TTCCCATTCTCAGCCTTGAC3"。

1.3 肥大心肌细胞H9C2模型的建立、siRNA转染及siRNA干扰的心肌细胞H9C2中ANP、BNP的检测

1.3.1 细胞分组及肥大心肌细胞H9C2 模型的建立 心肌细胞H9C2 采用DMEM 培养基添加10%胎牛血清。在37 ℃、5%CO2与饱和湿度的条件下进行培养，每两天换液一次，待细胞密度为80%～90%，用不含血清的培养基饥饿过夜后分为ISO 50 μmol/L组、ISO 100 μmol/L 组、细胞对照组，ISO 50 μmol/L与ISO 100 μmol/L 组中分别添加50与100 μmol/L 的ISO，细胞对照组不作处理，48 h 后收集细胞，采用1.3 中实时定量PCR 法，检测各组ANP mRNA、BNP mRNA 及rno_circRNA_016002，发现相比于细胞对照组，ISO 50 μmol/L 与ISO 100 μmol/L 组中ANP mRNA 与BNP mRNA 的表达均升高，证明肥大细胞模型造模成功。

1.3.2 心肌细胞H9C2 siRNA转染及分组 用焦碳酸二乙酯处理过的水将siRNA干粉溶解为20 μmol/L的储备液。转染试剂采用Lipofectamine RNAiMAX（美国ThermoFisher Scientific 公司）。具体操作按照转染试剂说明书操作。si-rno_circRNA_016002 siR‑NA 干扰序列为5"UUUAAAUACUAAAUUAUGC3"。将 心 肌细胞H9C2 分为siRNA+ISO 50 μmol/L 组、siRNA+ISO 100 μmol/L 组、siRNA 组、阴性对照组，其中阴性对照组中只加入转染试剂，siRNA 组中加入siRNA 与转染试剂，siRNA+ISO 50 μmol/L 与siR‑NA+ISO 100 μmol/L 组分别用siRNA 与转染试剂干扰后，加入50与100 μmol/L的ISO处理饥饿过夜，加入ISO 48 h 后收集细胞，siRNA 组、siRNA+ISO 50 μmol/L 组 与siRNA+ISO 100 μmol/L 组 中rno_cir‑cRNA_016002 的表达水平分别为0.3367 ± 0.01、0.5967 ± 0.01、0.5067 ± 0.01，阴 性 对 照 组 中rno_circRNA_016002 的表达水平为1.125 ± 0.03。与阴性对照组相比，各组rno_circRNA_016002 的表达水平均降低（P<0.01）。说明心肌细胞H9C2 转染成功。

1.3.3 siRNA 干扰的心肌细胞H9C2中ANP mRNA与BNP mRNA 的检测 采用1.3 中实时定量PCR法，每组收集1×107个细胞检测siRNA 干扰的心肌细胞H9C2 中ANP mRNA 与BNP mRNA。实时定量PCR 所使用引物如下：rno_circRNA_016002 上游引物为5"CGGGGATCCAACTTCCAGTG3"，下游引物为5"ACCTGCATGTGATTGCCCTAT3"；ANP 上游引物为5"GGATTTCAAGAACCTGCTAGA3"，下游引物为5"GCTTCATCGGTCTGCTCGC3"；BNP 上 游 引 物 为5"CTCTGGGACCACCTCTCAAG3"；下 游 引 物 为5"CAAGTTTGTGCTGGAAGATAAG3"；GAPDH 上 游引物为5"TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC3"，下游引物为5"TTCCCATTCTCAGCCTTGAC3"。

1.3.4 siRNA 干扰的心肌细胞H9C2 中ANP、BNP蛋白的检测 采用Western blotting 法。收集3×106个细胞，用Western 及IP 细胞裂解液裂解细胞，冰浴、超声、离心后吸取的上清即为总蛋白，采用BCA Protein Assay Kit进行蛋白定量。取等量蛋白经12%的聚丙烯酰胺电泳后采用半干转转移至PVDF 膜上，利用TBST 配制的5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗GAPDH（稀释比例1∶1 000）、ANP（稀释比例1∶1 000）、BNP（稀释比例1∶1 000）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3 次，每次10 min。二抗山羊抗兔抗体（稀释比例1∶10 000）、山羊抗鼠抗体（稀释比例1∶10 000）室温孵育1 h 后，TBST 洗膜3 次，每次10 min。采用Pierce ™ECL Western blotting Substrate检 测，BIORAD ChemiDoc XRS 凝胶成像系统进行记录拍照。Image J 软件测量蛋白条带的灰度值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白的相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间比较采用LSD-t 检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肥厚的心肌组织中rno_circRNA_016002 表达的变化 ISO 组及Control 中rno_circRNA_016002 相对表达量分别为1.703 ± 0.03、1.142 ± 0.05，两组比较，P<0.01。

2.2 肥大心肌细胞中rno_circRNA_016002 表达的变化 ISO 50 μmol/L、ISO 100 μmol/L 组及细胞对照组中rno_circRNA_016002 的相对表达量分别为1.883±0.02、2.123±0.008、1.133±0.03；与细胞对照组相比，ISO 50 μmol/L 与ISO 100 μmol/L 组中rno_circRNA_016002的表达量均升高（P<0.01）。

2.3 siRNA 干扰的心肌细胞H9C2 中ANP mRNA、ANP 蛋白、BNP mRNA、BNP 蛋白表达的变化 与阴性对照组相比较，siRNA+ISO 50 μmol/L 组与siR‑NA+ISO 100 μmol/L 组中ANP、BNP 的mRNA 与蛋白质水平差异无统计学意义（P 均>0.05）。见表1及图1。

表1 三组ANP mRNA、ANP蛋白、BNP mRNA、BNP蛋白表达比较（X±S）

图1 三组ANP、BNP 蛋白电泳图

3 讨论

心肌肥厚作为一种在正常生理、病理条件下，或神经激素刺激下的一种适应性反应，伴随着心肌细胞H9C2 体积的增大、蛋白合成的增强乃至ANP、BNP等众多婴儿基因的重新表达［10］。长期的心肌肥厚会发展为心衰，乃至诱发死亡。近年来越来越多的研究表明，包括环状RNA、长链非编码RNA 在内的多种非编码RNA 在包括心肌肥厚在内的多种生理或病理生理学过程中起到了重要的调控作用［11］。

circRNA 属于ncRNA，它们由DNA 转录产生而不发生转录后翻译。与LncRNA 不同，circRNA 是通过特定的反向剪接机制形成的共价闭合的单链RNA 分子［12-13］。 circRNA 的潜在功能仍然有待研究，某些circRNA 通过控制宿主基因的mRNA 表达而参与基因的调控，而另一些circRNA 则具有反式作用。 通过与miRNA/mRNA 结合竞争，它们可以充当特定miRNA 的有效海绵，或作为RBP 的诱饵，可以直接或间接调节基因表达［14-16］。由于这些潜在的作用，circRNA 被认为是重要的表观遗传与许多生理过程的调节剂。根据文献中高通量测序的结果显示，在ISO 诱导的心肌肥厚模型中，3 323 个环状RNA 中，有401 个环状RNA 存在差异性表达，其中303个表达水平上调，而98个表达水平下调［17］。Cir‑cRNA_000203 可以通过抑制miR-26b-5P 和miR-140-3P，结合GATA4，进而促进心肌肥厚的病理过程［18］。心肌细胞中环状RNA HRCR 表达水平的提高，可以通过在细胞质中抑制miR-233，从而减弱心肌肥厚及心衰的发生［19］。环状RNA circslc8a1 可以作为吸收miR-133a 的内源性海绵，并且可以作为治疗心肌肥厚的药物靶点［20］。而环状RNA circHIPK3可以通过miR-29b-3p 抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心脏纤维化。血清中的环状RNA circTMEM56 和circDNAJC6 可以在肥厚性梗死心肌病中起到疾病进程标志物的作用［21］，然而关于环状RNA rno_cir‑cRNA_016002 在心肌肥厚中的作用尚不明确，需要更进一步的深入研究。

本研究发现，环状RNA rno_circRNA_016002 在ISO 诱导的大鼠心肌肥厚模型过表达。H9C2 细胞在ISO 的刺激下，rno_circRNA_016002 表达水平显著升高。采用siRNA 干扰rno_circRNA_016002表达后，ISO 刺激并不能使rno_circRNA_016002 表达水平回到阴性对照组的水平，并且心肌肥厚标志物ANP 和BNP 表达水平也未能够在ISO 的诱导下实现表达水平的上调，说明rno_circRNA_016002 在心肌肥厚的过程中起到了重要的调控作用，抑制rno_cir‑cRNA_016002 的表达可以阻止ISO 诱导的心肌肥厚过程。本研究为环状RNA 在心肌肥厚过程中调控作用提供了新的思路和理论基础。

综上所述，ISO 诱导的大鼠肥厚的心肌组织和肥大心肌细胞中rno_circRNA_016002 表达水平上调，并且参与了心肌肥厚过程，为心肌肥厚的治疗提供了新的靶点，然而rno_circRNA_016002 调节心肌肥厚的具体机制尚不明确，有待进一步的研究。