食管鳞状细胞癌组织中IRAIN 的表达变化及启动子甲基化状态观察

邓镇生，林青，田作春，李才，许静红

三亚中心医院，海南三亚572000

表观遗传学是影响食管癌发生、发展的重要因 素之一［1］。长链非编码RNA（LncRNA）虽然本身并不编码蛋白分子，但是可以通过表观遗传学改变、转录调控、转录后调控等影响肿瘤相关基因的表达［2］。胰岛素样生长因子1 受体长链非编码RNA（IRAIN）（美国国立生物信息中心基因库Gene ID：104472848）是已知的具有反式调节作用的Ln‑cRNA，在胰腺癌［3］、非小细胞肺癌［4］和乳腺癌［5］等恶性肿瘤中表达下调。IGF-1/IGF-1R 信号通路是调控食管癌细胞增殖、迁移、侵袭等的重要途径之一［6］，而作为IGF-1R 的反义转录基因，IRAIN 可竞争性抑制肿瘤细胞中IGF1R 的表达，故推测IRAIN 在食管癌中可能也发挥着重要作用。此外，通过检索基因序列，我们发现IRAIN 启动子存在CpG 岛，其表观遗传学改变是否是影响该基因活性的重要原因目前仍未见报道。本研究中我们探讨了食管鳞状细胞癌（ESCC）组织和癌旁正常组织中IRAIN 的表达以及启动子甲基化状态差异，并探讨了ESCC 组织中IRAIN 的启动子甲基化状态与患者临床病理参数的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2018 年5 月-2020 年5 月于三亚市中心医院心胸外科经手术切除的ESCC 患者63例，男38 例、女25 例，年龄37.0～71.0 岁、中位年龄56.0 岁。依据国际抗癌联盟（UICC）与美国癌症联合会（AJCC）发布的第八版食管癌TNM 分期系统［7］对患者进行肿瘤分期：Ⅰ期9 例（14.29%）、Ⅱ期28例（44.44%）、Ⅲ期22 例（34.92%）、Ⅳ期4 例（6.35%）。手术中取原发性ESCC 肿瘤组织和相匹配的邻近（距离肿瘤灶边缘≥3 cm）食道正常黏膜组织，一部分制作蜡块，另一部分立即放入-80 ℃保存备用。术前均未接受任何新辅助治疗，且在入组前签署知情同意书。

1.2 ESCC 组织及癌旁组织中IRAIN 的检测 采用QPCR 法。术中获取患者新鲜肿瘤组织及癌旁组织，分别各取100 μg，匀浆后，加入Trizol 试剂提取总RNA。使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit 试剂盒配制逆转录反应体系，37 ℃15 min（逆转录反应），85 ℃5 s（酶失活反应），得到cDNA。采用SYBR Green 荧光染料掺入法进行PCR 扩增，预变性阶段：95 ℃3 min；热循环阶段：95 ℃30 s，65 ℃30 s，72 ℃40 s，32 个循环；熔解曲线：95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。IRAIN：PCR 上游引物：5‘GAAGTCTG‑GCTCCGGAGGAGGGTC3’；下 游 引 物5‘ATGTG‑GAGGTAGCCCTCGATCAC3’。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的表达量，内参为GAPDH。2-ΔΔCt≤1.0为低表达，2-ΔΔCt>1.0为高表达。·

1.3 ESCC 组织及癌旁组织中IRAIN 启动子甲基化率的测算 采用MSP 法。术中获取患者新鲜肿瘤组织及癌旁组织，分别各取100 μg，匀浆后，采用QIAamp DNA Mini Kit 试剂盒提取组织DNA。将获取的DNA置于-20 ℃保存备用。采用核酸定量仪检测DNA 含量和纯度，A260/A280为1.60～1.90，说明样本纯度较高。取2 μg DNA 样本，利用琼脂糖凝胶电泳证实电泳条带清晰，说明DNA 完整度良好。采用EZ DNA 甲基化试剂盒对DNA 样本进行亚硫酸盐修饰。将修饰后的DNA 进行PCR 扩增反应。PCR 的反应条件设定为：97 ℃2 min，1 个循环；97 ℃30 s，65 ℃30 s，72 ℃30 s，40个循环后72 ℃10 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。IRAIN 启动子甲基化上游引物：5′TCGGGGGATGGAGGGGTATTAGGGT3′，下 游 引 物：5′CCCGACACCACCAAAACAAAAAC‑TATC3′；未甲基化上游引物：5′TTGGGGGATG‑GAGGGGTATTAGGGT3′，下游引物5′CCCAACAC‑CACCAAAACAAAAACTATC3′。MSP 结果判读：完全甲基化：甲基化特异引物扩增出目的条带，而非甲基化特异引物没有扩增出目的条带；部分甲基化：甲基化特异引物和非甲基化特异引物均扩增出目的条带；非甲基化：非甲基化特异引物扩增出目的条带，而甲基化特异引物没有扩增出目的条带。我们将完全甲基化与部分甲基化均按甲基化统计。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件。计量资料以表示，比较采用t 检验；计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验或McNemarχ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ESCC 组织及癌旁正常组织中IRAIN 表达及启动子甲基化率比较 ESCC 组织和癌旁正常组织中IRAIN 表 达 量 分 别 为0.816 ± 0.286、1.000 ±0.185，两者比较，t=4.288，P=0.000。ESCC 组织和癌旁正常组织中IRAIN 启动子甲基化率分别为58.73%（37/63）和19.05%（12/63），两者比较，χ2=20.872，P=0.000。ESCC 组织中IRAIN 启动子甲基化以部分甲基化为主，见图1。

2.2 不同启动子甲基化状态ESCC组织中IRAIN表达比较 IRAIN 启动子甲基化和非甲基化ESCC 组织IRAIN 相对表达量分别为0.661 ± 0.256、1.037± 0.149，IRAIN 高表达分别为6（16.22%）、16 例（61.54%）。两组IRAIN 相对表达量比较，t=6.722，P<0.05；RAIN高表达率比较，χ2=13.802，P<0.05。

图1 ESCC组织及癌旁正常组织中IRAIN的启动子甲基化状态电泳图

2.3 ESCC 组织中HOTAIR 启动子甲基化状态与患者临床病理参数的关系 ESCC 组织中IRAIN 启动子甲基化状态与患者肿瘤最大直径、TNM 分期、淋巴结转移有关（χ2分别为13.607、25.581、5.039，P均<0.05），但是与患者年龄、性别、肿瘤位置、分化程度、脉管侵犯、神经侵犯无关（χ2分别为1.021、0.128、0.019、3.147、0.524、2.423，P 均>0.05），详见表1。

3 讨论

近年随着转录组学的深入研究和生物信息学技术的发展，ESCC 的恶性进展机制已取得了不少进步，多数研究不止关注蛋白编码RNA，越来越多的非编码RNA 被发现，且被证实在表观遗传调控、基因转录，转录后调节和蛋白质的翻译后修饰等过程中都发挥着关键作用［8］。LncRNAs 是一类长度超过200 nt 的非编码RNAs，与小分子RNA 相比数量多、种类多、作用模式多样［9］，作为潜在的抑癌基因或癌基因，逐渐引起众多学者的关注。

根据基因组定位和作用方式，LncRNAs 可分为基 因 内LncRNAs、基 因 间LncRNAs、增 强 子Ln‑cRNAs、有义重叠LncRNAs和双向LncRNAs［10］，其中有义重叠LncRNAs 即在DNA 的有义链中与一个或多个不同蛋白质编码基因的内含子和外显子重叠，包括正义重叠LncRNAs、反义重叠LncRNAs。IRAIN 是近年新发现的一类反义重叠LncRNA，其转录方向与IGF-1R 编码基因相反［11］。KANG 等［5］已经证实，IRAIN 表达均来自于父源等位基因，属于IGF-1R 父源印迹基因。IGF-1R 是由2 个α 亚基和2个β 亚基组成的四聚体结构跨膜酪氨酸激酶受体，其同源配体为IGF-1 和IGF-2。IGF-1R/IGF-1/2 轴为丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶/雷帕霉素靶蛋白通路和磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B 通路的上游途径，因此IGF-1R 是维持众多肿瘤细胞恶性表型的关键分子之一。张俊凯等［12-13］均证实IGF-1R 蛋白在食管癌组织中表达量显著上调，并且通过小RNA 干扰技术沉默IGF-1R 基因表达后，食管鳞癌细胞EC-9706 的增殖能力显著降低。本研究中，我们通过免疫组化染色法也证实，IGF-1R 蛋白在ESCC组织中的阳性表达率高于癌旁正常组织，因此认为IGF-1R 可能是ESCC 进展的先决条件，有望成为食管癌临床治疗的干预靶点。

表1 ESCC组织中IRAIN启动子甲基化状态与患者临床病理参数的关系（例）

本研究中我们通过QPCR 法证实，ESCC 组织中作为IGF-1R 反义转录的印迹基因的IRAIN 表达水平低于癌旁正常组织，并且与患者肿瘤最大直径、TNM 分期、淋巴结转移有关，故推测IRAIN 在ESCC恶性化进程中可能具有抑癌基因的活性，与在肝癌、喉鳞癌等样本中的检测结果一致。赵炎斌等［14］证实IRAIN 在肝癌组织中的表达水平降低，且与肝癌的恶性程度等病理特征有关。王健艳等［15］则通过对gDNA 测序IRAIN SNP 位点（rs8034564）为杂合子的喉癌患者进行cDNA 测序，证实IRAIN 在喉癌组织、癌旁组织和正常咽部黏膜中均呈双等位基因表达，而且IRAIN在喉癌组织和癌旁组织中的等位基因存在不平衡表达，但是在正常咽部黏膜中不存在不平衡表达，且喉癌组织中IRAIN 表达量低于正常咽部黏膜和癌旁组织；说明IRAIN对于肝癌、喉癌等恶性肿瘤的生长也有一定的抑制活性。表观遗传学修饰是众多LncRNA 遗传印记常见的调控机制，这可能与印记基因的印记控制区不稳定有关。在本研究中，我们发现IRAIN同样存在启动子甲基化状态，且ESCC 组织中IRAIN 启动子甲基化率高于癌旁正常组织，这可能是ESCC组织中IRAIN表达量降低的重要机制之一。

综上所述，IRAIN 在ESCC 组织中的表达量降低，可能与其启动子甲基化状态有关；随着ESCC 恶性化进展，IRAIN 启动子甲基化率也逐渐升高，因此IRAIN 有望成为将来ESCC 基因治疗的新靶点。但是由于我们对于LncRNAs 的研究仍处于起步阶段，而且现有的技术手段有限，因此对于LncRNAs 的认识和研究还很肤浅，例如IRAIN 如何调控正义转录物IGF-1R 表达；作为单等位基因，IRAIN 等位基因的不平衡表达是否与不编码功能有关等都将成为日后研究的重点。